石 毅，劉忠英，盧澤源，劉 迪，劉彬彬，周余來，劉 志

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)數(shù)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

中藥馬勃對大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響

石 毅1，劉忠英2，盧澤源＊，劉 迪1，劉彬彬Δ，周余來1，劉 志3

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)數(shù)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

目的：中藥馬勃作用于體外培養(yǎng)大鼠皮膚的成纖維細(xì)胞，觀察大鼠成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的能力，探討馬勃有效組分在細(xì)胞水平上促皮膚患處愈合的作用機(jī)制。方法：運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對新生大鼠乳鼠皮膚的成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為對照組（不給藥組）和馬勃有效組分37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1組；實(shí)驗(yàn)組于傳代培養(yǎng)24h后加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后收集細(xì)胞。采用MTT比色法測定細(xì)胞增殖，生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞膠原含量。結(jié)果：與對照組比較，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1實(shí)驗(yàn)組的成纖維細(xì)胞增長率和成纖維細(xì)胞膠原合成能力均顯著性升高（P＜0.01）。在藥物作用時(shí)間方面，與對照組比較，在24、48和72h觀察細(xì)胞增殖率和膠原合成能力均顯著增強(qiáng)，72h最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：在不同劑量馬勃有效組分作用下，大鼠成纖維細(xì)胞活化增殖，膠原合成的能力增強(qiáng)。

馬勃；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；膠原合成

馬勃為馬勃科植物脫皮馬勃、大頹馬勃、紫頹馬勃的干燥子實(shí)體。具有清肺利咽、止血之功效，可促進(jìn)傷口愈 合［1］。 現(xiàn) 代 研 究 發(fā) 現(xiàn)［2－4］： 馬 勃 在 抗腫瘤方面也有積極作用。近年來馬勃中的化學(xué)成分在抗菌和抗癌方面表現(xiàn)出特殊作用，受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注［5］。馬勃煎劑能抑制金黃色葡萄糖球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌和變形桿菌生長，在創(chuàng)傷愈合時(shí)起到抗菌消炎的作用。馬勃亦可以治療褥瘡［6－7］。目前關(guān)于馬勃促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和修復(fù)方面的研究較少，其中有效組分及其對受損細(xì)胞的影響機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究馬勃有效組分對大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的作用，探討馬勃有效組分促皮膚患處愈合在細(xì)胞水平上的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)治療褥瘡的中藥新藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于北京四季青公司；中性蛋白酶試劑盒、MTT試劑盒及膠原酶試劑盒購于Sigma公司；胰蛋白酶購于Genview公司。倒置相差熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；高壓滅菌鍋、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；酶標(biāo)儀EXL－808Ⅰ（德國Eppendorf公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)大鼠乳鼠購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部，動(dòng)物生產(chǎn)批號：SCXK（J）2007－0003，動(dòng)物合格證號：0021833。

1.3 馬勃促大鼠成纖維細(xì)胞增殖有效組分提取、分離［8］利用水、乙醇、乙酸乙酯和石油醚4種極性不同的溶劑分離提取馬勃，得到馬勃提取物，作用于體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細(xì)胞，觀察各組分對成纖維細(xì)胞生長的影響，篩選出馬勃有效組分為80%乙醇提取物。

1.4 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取1～7d新生大鼠的乳鼠背部皮膚，通過4.0%中性蛋白酶、0.25%膠原酶進(jìn)行消化、分離、培養(yǎng)得到原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，再用0.25%胰酶進(jìn)行消化、分離、培養(yǎng)，得到傳代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分為對照組和37.5、75.0、150.0和300.0mg·L－1馬勃實(shí)驗(yàn)組，馬勃實(shí)驗(yàn)組于傳代培養(yǎng)24h后加入不同劑量的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h后收集細(xì)胞。

1.5 成纖維細(xì)胞增殖率的測定［9］成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中（邊緣孔用無菌PBS填充），培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組按不同藥物劑量給藥，對照組給PBS，每組6個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24、48和72h，依據(jù)3個(gè)時(shí)間分別在每孔中加MTT（20μL／well），37℃ 培養(yǎng) 4h，3 500r·min－110min，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）200μL／well，充分振蕩，使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，然后在酶標(biāo)儀上于490nm波長處測定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組A值－對照組A值）／對照組A值×100%。

1.6 生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定成纖維細(xì)胞膠原含量 成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中（邊緣孔用無菌PBS填充），培養(yǎng)24、48、72h后，實(shí)驗(yàn)組按不同藥物劑量給藥，對照組給PBS，每組6個(gè)復(fù)孔，5%CO2、37℃孵育，培養(yǎng)48h，試劑盒檢測，依照試劑盒說明書在450nm處進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計(jì)算樣品的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，成纖維細(xì)胞增殖測定的A值、成纖維細(xì)胞膠原含量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同溶劑馬勃提取物作用下成纖維細(xì)胞增殖率 水、乙醇、乙酸乙酯和石油醚4種馬勃提取物對成纖維細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，且隨劑量的增大而遞增，其中馬勃乙醇和水提取物對成纖維細(xì)胞增殖的作用較好。見圖1。

圖1 馬勃粗提物作用后成纖維細(xì)胞增殖率的變化Fig.1 The changes of proliferation rates of fibroblasts after treated with crude extracts from puffball

2.2 不同含量乙醇提取物作用下成纖維細(xì)胞增殖率 用水和30%、60%及80%乙醇對馬勃進(jìn)行提取，得4種不同組分，采用MTT法測定成纖維細(xì)胞增殖率的變化，結(jié)果顯示：馬勃水提物及各濃度乙醇提取物對成纖維細(xì)胞的增殖均有不同程度的促進(jìn)作用，其中馬勃80%乙醇提取物對成纖維細(xì)胞增殖作用最明顯。見圖2。

圖2 馬勃乙醇提取物作用后成纖維細(xì)胞增殖率的變化Fig.2 The changes of proliferation rate of fibroblasts after treated with ethanol extracts from puffball

2.3 不同劑量的馬勃有效組分作用下成纖維細(xì)胞增殖的變化 用含不同劑量的馬勃有效組分（80%乙醇提取物）的培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖情況。與對照組比較，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1馬勃實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增長率有顯著性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。在藥物作用時(shí)間上，與對照組比較，馬勃實(shí)驗(yàn)組在24、48和72h細(xì)胞增殖率均顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見表1。

2.4 不同劑量有效組分作用下成纖維細(xì)胞膠原含量的變化 與對照組比較，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1馬勃實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞膠原含量有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。在藥物作用時(shí)間方面，與對照組比較，馬勃實(shí)驗(yàn)組在24、48和72h觀察膠原含量均有顯著增強(qiáng)，72h最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見表2。

表1 各組成纖維細(xì)胞增殖率的變化Tab.1 The changes of the proliferation rates of fibroblasts in various groups （n＝6，±s）

表1 各組成纖維細(xì)胞增殖率的變化Tab.1 The changes of the proliferation rates of fibroblasts in various groups （n＝6，±s）

＊P＜0.01compared with control group.

Group A490nm Proliferation rate（η／%）24 48 72 Control 0.093±0.002 0.096±0.004 0.098±0.008（t／h）24 48 72 0 0 0 Puffball（mg·L－1）37.5 0.116±0.008＊ 0.126±0.008＊ 0.131±0.100＊ 25＊ 31＊ 34＊75.0 0.130±0.009＊ 0.138±0.009＊ 0.142±0.090＊ 40＊ 44＊ 45＊150.0 0.145±0.008＊ 0.155±0.008＊ 0.164±0.060＊ 56＊ 61＊ 67＊300.0 0.140±0.008＊ 0.152±0.005＊ 0.161±0.110＊ 51＊ 58＊ 64＊

表2 各組成纖維細(xì)胞合成膠原含量的變化Tab.2 The changes of the collagen contents of fibroblasts in various groups ［n＝6，±s，ρB／（μg·L－1）］

表2 各組成纖維細(xì)胞合成膠原含量的變化Tab.2 The changes of the collagen contents of fibroblasts in various groups ［n＝6，±s，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.01compared with control group.

Group Collagen content（t／h）24 48 72 Control 0.83±0.12 0.86±0.12 0.88±0.12 Puffball（mg·L－1）37.5 1.26±0.08＊ 1.26±0.10＊ 1.37±0.10＊75.0 2.26±0.09＊ 2.37±0.09＊ 2.36±0.09＊150.0 2.90±0.08＊ 3.12±0.08＊ 3.26±0.06＊300.0 3.01±0.08＊ 3.16±0.05＊ 3.29±0.11＊

3 討 論

褥瘡是臨床主要并發(fā)癥之一，易并發(fā)感染而危及生命［10］，目前多選用西藥治療。中藥馬勃以清熱解毒、去腐生肌為主，在治療創(chuàng)傷愈合時(shí)具有抗菌消炎作用，而對于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和修復(fù)方面的報(bào)道較少，其中馬勃的有效組分對受損細(xì)胞的影響機(jī)制尚未明確。本研究以大鼠皮膚成纖維細(xì)胞作為研究對象，研究馬勃有效組分對成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成的影響，以探討治療褥瘡的中藥治療作用。

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，是進(jìn)入傷口的成纖維細(xì)胞增殖、分化和膠原合成等綜合作用的結(jié)果。當(dāng)皮膚破損后，成纖維細(xì)胞增殖以及膠原更新是影響傷口重建的關(guān)鍵，其主要依賴于膠原酶的作用，而膠原酶來源于纖維細(xì)胞［11］。研究［12］證明：成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性改變，即增殖能力增強(qiáng)和膠原蛋白合成增多在創(chuàng)面愈合形成過程中發(fā)揮著重要作用。因而通過改善成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合的速度。成纖維細(xì)胞又是參與創(chuàng)傷修復(fù)的主要細(xì)胞，具有合成膠原、纖維黏連蛋白及透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)的功能，同時(shí)還可分泌多種生長因子來調(diào)控修復(fù)創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示：馬勃有效組分在細(xì)胞水平上對皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用，具有劑量和時(shí)間的依賴關(guān)系，劑量為37.5～150.0mg·L－1范圍內(nèi)，隨著馬勃?jiǎng)┝康脑黾?，對成纖維細(xì)胞增殖效果隨之增加。但當(dāng)藥物劑量加大到300mg·L－1時(shí)，增殖效果反而略有降低，其中以150mg·L－1劑量促進(jìn)增殖作用最顯著?？梢姡ㄟ^調(diào)節(jié)馬勃有效組分劑量，可以對成纖維細(xì)胞增殖幅度進(jìn)行調(diào)控。從給藥作用時(shí)間方面觀察，隨著時(shí)間的推移，成纖維細(xì)胞增殖效率增強(qiáng)，48h細(xì)胞增殖效率顯著增強(qiáng)，以72h為最強(qiáng)。不同劑量馬勃有效組分對成纖維細(xì)胞膠原合成劑量效應(yīng)顯示：馬勃?jiǎng)┝繛?7.5～150.0mg·L－1范圍內(nèi)，成纖維細(xì)胞膠原合成均有顯著增強(qiáng)，并隨著給藥劑量增高，成纖維細(xì)胞膠原合成能力增強(qiáng)，劑量為300mg·L－1時(shí)與150mg·L－1作用于成纖維細(xì)胞膠原合成能力基本相同。從給藥作用時(shí)間方面觀察，隨著作用時(shí)間增加，膠原合成能力增強(qiáng)。

綜上所述，通過調(diào)節(jié)馬勃有效組分劑量，不僅可以對成纖維細(xì)胞增殖幅度進(jìn)行調(diào)控，也可以對成纖維細(xì)胞膠原合成進(jìn)行調(diào)控，改變成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征，本研究為中藥馬勃有效組分對促患處愈合在細(xì)胞水平上的作用機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)中藥新藥奠定了基礎(chǔ)。

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＊延邊大學(xué)藥學(xué)專業(yè)2009級

Δ吉林大學(xué)文學(xué)院2010級

Effects of traditional puffball on proliferation and collagen synthesis of skin fibroblasts in rats

SHI Yi1，LIU Zhong－ying2，LU Ze－yuan＊，LIU Di1，LIU Bin－binΔ，ZHOU Yu－lai1，LIU Zhi3
（1.Center for Biological Engineering Experiment，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Drug Analysis，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.School of Mathematics，Jilin University，Changchun 130012，China）

Objective To study the effects of puffball on proliferation and collagen synthesis on rat skin fibroblasts，and to investigate the mechanism of enhancing wound healing of active constituent of puffball at the cells level.Methods The rat skin fibroblasts were divided into 5groups，all the cells were treated with puffball（37.5，75.0，150.0and 300.0mg·L－1），except for control group，for 24，48and 72h，respectively.And then MTT was used to detect the proliferation，and the content of collagen were measured by double antibody sandwich ELISA.Results Compared with control group，the cells treated with different concentrations（37.5，75.0，150.0and 300.0mg·L－1）of puffball showed a significant rise both in its proliferation and the ability of collagen synthesis（P＜0.01）.Furthermore，in time－dependant manner，the proliferation rate of cells and collagen synthesis ability were significantly increased after treated for 24，48，72h，especially in 72h（P＜0.01）.Conclusion Puffball with different doses can enhance the proliferation and collagen synthesis in skin fibroblasts of rats.

puffball；fibroblast；cell proliferation；collagen synthesis

R965

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0961－04

2012－04－11

吉林省中醫(yī)藥管理局資助課題 （2010－pt063）

石 毅 （1962－），女，吉林省長春市人，研究員，主要從事中藥生物工程的研究。

劉 志 （Tel：0431－85166967，E－mail：liuzhi＠jlu.edu.cn）