于洪泉，張 宇，金 宏，趙東海，楊淑艷，齊 玲

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體表達(dá)與TRAIL誘導(dǎo)凋亡的關(guān)系

于洪泉1，張 宇1，金 宏2，趙東海2，楊淑艷2，齊 玲2

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

目的：通過研究惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)凋亡的關(guān)系，初步探討TRAIL誘導(dǎo)凋亡抵抗的機(jī)制。方法：分離惡性膠質(zhì)瘤組織，獲得和培養(yǎng)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用100μg·L－1TRAIL作用后采用酸性磷酸酶法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平；Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體的水平。結(jié)果：獲得3株（GC417、GC321、GC125）原代惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞；3株細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感程度不同［GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）和GC125（0.22±0.01vs0.36±0.01）］，對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用敏感，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡不敏感。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體表達(dá)不同，GC321和GC125表達(dá)增高，GC417表達(dá)減少。結(jié)論：不同來源的原代培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)不同，死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體表達(dá)也不同，死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體表達(dá)的減少可能與凋亡抵抗的發(fā)生密切相關(guān)。

膠質(zhì)瘤；死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；細(xì)胞凋亡

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）作用于細(xì)胞后，主要是通過形成死亡誘導(dǎo)信 號(hào) 復(fù) 合 體 （death－inducing signaling complex，DISC），使caspase－8活化，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。所以，DISC中任一成分對(duì)TRAIL凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)都很重要，發(fā)生錯(cuò)誤時(shí)會(huì)導(dǎo)致TRAIL凋亡通路阻斷。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究［2－3］表明：DISC在TRAIL凋亡傳導(dǎo)通路中占有非常重要的地位，因此，本文作者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究DISC在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用，為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)［4］取新鮮人腦膠質(zhì)瘤組織（吉林大學(xué)第一醫(yī)院提供，病理診斷為Ⅲ－Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤）。冷PBS沖洗后將組織剪成小塊（1mm×1mm×1mm），置于離心管中，加入胰酶消化，37℃孵育30min，離心棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，加入10%DMEM／F12培養(yǎng)液（Gibco公司），以1×106／75cm2細(xì)胞密度接種后將培養(yǎng)瓶置入37℃、5%CO2孵箱、于飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代，獲得3株原代培養(yǎng)的GC417、GC321及GC125惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

1.2 酸性磷酸酶法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性 待細(xì)胞融合至85%，0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，將細(xì)胞分為4組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入TRAIL（100μg·L－1），對(duì)照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。作用24h，小心棄上清，PBS洗去培養(yǎng)基，每孔加入酸性磷酸酶底物檢測(cè)液（對(duì)硝基苯新鮮配制）100μL，繼續(xù)培養(yǎng)90min，加入終止液，室溫下孵育5min。酶標(biāo)儀405nm處測(cè)定各孔吸光度（A）值。

1.3 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中DISC成分細(xì)胞培養(yǎng)3d，待細(xì)胞生長(zhǎng)90% 左右，棄去培養(yǎng)液，加入0.01mol·L－1PBS充分洗滌細(xì)胞，棄去PBS，0.25%胰酶消化，將細(xì)胞收集于1.5mL離心管中，3 000r·min－1離心5min，棄上清。PBS充分洗滌細(xì)胞，離心后棄上清，每個(gè)樣品加入50μL的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞充分裂解后，12 000g、4℃離心15min，上清移于另一管中，棄去沉淀，Braford測(cè)定法檢測(cè)樣品蛋白濃度，SDS－PAGE電泳分離樣品，4℃轉(zhuǎn)膜封閉后，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜后，加入相應(yīng)的二抗，室溫、避光孵育1h，膠片曝光拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，凋亡敏感性數(shù)據(jù)以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性原代培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，經(jīng)100μg·L－1TRAIL作用后檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)3株原代培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感程度不同，GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）和GC125（0.22±0.01vs0.36±0.01）對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用敏感，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而 GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡不敏感

2.2 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞DISC成分表達(dá)情況Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：在3株原代培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，DISC各成分均有表達(dá)，但略有不同，對(duì)TRAIL敏感的GC321細(xì)胞，DR5、caspase－8和Fas相關(guān)蛋白（FADD）表達(dá)均有增高，而對(duì)TRAIL不敏感的GC417細(xì)胞表達(dá)則明顯減少（圖1）。

圖1 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中DISC蛋白的表達(dá)Fig.1 Expressions of DISC proteins in glioma cells

3 討 論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，其發(fā)病率并不高，但由于其隱匿性，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)均為惡性，所以給臨床治療帶來了很大困難。由于膠質(zhì)瘤在腦內(nèi)呈彌散性分布［5］，經(jīng)手術(shù)難以清除，且現(xiàn)有的多種治療方法對(duì)患者生存期的延長(zhǎng)意義不大。研究［6－7］發(fā)現(xiàn)：惡性膠質(zhì)瘤可能是由于激活了細(xì)胞的生長(zhǎng)途徑和／或抑制了細(xì)胞的凋亡途徑而對(duì)治療產(chǎn)生抵抗。TRAIL是腫瘤壞死因子超家族中的一員［8－9］，其在腫瘤免疫監(jiān)視過程中起一定作用［10］，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞無明顯毒性作用［11］，TRAIL的這一特性使之成為腫瘤治療藥物研究的熱點(diǎn)。但研究［12－13］發(fā)現(xiàn)：在多種腫瘤細(xì)胞中存在著TRAIL抵抗現(xiàn)象，其發(fā)生抵抗的機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3株原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，酸性磷酸酶法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：在3株原代培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，各細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性不同，DISC各成分表達(dá)也不同，對(duì)TRAIL敏感的GC321和GC125細(xì)胞中DISC成分表達(dá)明顯增高；而對(duì)TRAIL不敏感的GC417細(xì)胞中其表達(dá)則減少。這說明不同來源的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)性不同，與DISC表達(dá)明顯相關(guān)。因此，DISC的表達(dá)量減少可能與凋亡抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，但其抵抗的機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

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Relationship between expression of death－inducing signaling complex and apoptosis induced by tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand in malignant glioma cells

YU Hong－quan1，ZHANG Yu1，JIN Hong2，ZHAO Dong－h(huán)ai2，YANG Shu－yan2，QI Ling2
（1.Department of Neurosurgery，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Pathology，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Objective To discuss the relationship between the expression of death－inducing signaling complex（DISC）and apoptosis induced by tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand （TRAIL）in malignant glioma cells，and to explore the mechanism of resistance of TRAIL initiated apoptosis.Methods The primary cultured cells were isolated from human malignant glioma tissues，and the level of apoptotsis was detected by acid phosphatase assay after the cells treated with different doses of TRAIL；and the level of DISC protein was determined by Western blotting.Results The primary malignant glioma cells GC417，GC321and GC125were isolated and cultivated，and the sensitivities of the cells to TRAIL were different，GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）and GC125 （0.22±0.01vs0.36±0.01）were sensitive to TRAIL，there were significant differences compared with control group（P＜0.01）；but GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）was resistant to TRAIL.The results of Western blotting showed that the expressions of DISC proteins were various，and the expressions of GC321and GC125were increased，and the expression of GC417was decreased.Conclusion The responses are different according to the different primary malignant glioma cells to TRAIL－induced apoptosis，and the expressions of DISC proteins are either different；there is relationship between the decreasing of the expressions of DISC proteins and the resistance of TRAIL initiated apoptosis.

glioma；death－inducing signaling complex；tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand；apoptosis

R739.4

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0904－03

2012－06－18

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題 （202015242）；吉林省教育廳科研基金資助課題 （2012330）；吉林醫(yī)藥學(xué)院科研基金資助課題 （201101）；吉林省吉林市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題 （201233128）

于洪泉 （1974－），男，吉林省長(zhǎng)春市人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腦腫瘤研究。

齊 玲 （Tel：0431－88782331，E－mail：qiling1718＠163.com）