余曦明，楊勝梅，蔡明建，余望貽

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南斯奇生物制藥有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

卡介菌多糖核酸（BCG-Polysaccharides nucleic acid，BCG-PSN）是從卡介菌中經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸混合而制成的新型免疫調(diào)節(jié)劑，含有多糖及核酸等多種免疫活性物質(zhì)。BCG-PSN注射液是目前臨床上常用的免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平，增強(qiáng)機(jī)體抗感染和抗過敏的能力，多應(yīng)用于病毒感染性疾病、自身免疫性疾病等的輔助治療。本研究以BALB/c裸鼠及KM小鼠作為研究對(duì)象，系統(tǒng)檢測(cè)了BCG-PSN對(duì)裸鼠及正常小鼠的腹腔單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，以探討B(tài)CG-PSN對(duì)小鼠免疫功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c裸鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g；KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，年齡6～8周齡，均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SCXK（湘）2009-0004。

1.2 藥物及試劑

BCG-PSN注射液（商品名：斯奇康注射液，湖南斯奇生物制藥有限公司，批號(hào)：S20100410，規(guī)格：0.5 mg/mL，以0.5 mgBCG-PSN干粉溶于1 mL生理鹽水制成；BCG-PSN主要含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.1%的核酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.76%的多糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.66%的蛋白質(zhì)；臨用時(shí)用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液）；注射用胸腺肽（西安迪賽生物藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號(hào)：1105281-7，規(guī)格：40 mg/支）；生理鹽水（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）；5%雞紅細(xì)胞混懸液；1%淀粉自制。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將50只裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：BCG-PSN高、中、低劑量組，裸鼠陽性藥物（胸腺肽）對(duì)照組，裸鼠正常對(duì)照組，每組10只；KM小鼠，空白對(duì)照組10只。

1.3.2 給藥 BCG-PSN高、中、低劑量組：根據(jù)成人用藥量按體表面積換算成小鼠的等效劑量為中劑量（6.25 mg/kg），低劑量為中劑量的1/2倍，高劑量為中劑量的2倍；陽性對(duì)照組：予注射用胸腺肽給藥，按成人用藥量換算成小鼠的等效劑量（10 mg/kg）；裸鼠正常對(duì)照組和KM空白對(duì)照組：生理鹽水。各組用生理鹽水調(diào)整藥物濃度后均按0.5 mL/只腹腔注射，隔日1次，連續(xù)21 d。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 藥物對(duì)免疫缺陷的動(dòng)物腹腔單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響：采用半體內(nèi)法，于停藥后的第1天動(dòng)物腹腔注射無菌的1%淀粉2 mL，20 h后腹腔注射5%RBC雞紅細(xì)胞懸液2 mL，30 min后頸椎脫臼處死動(dòng)物，輕揉腹部，然后剖開腹腔，取出腹腔洗液分別滴于兩張載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，置37℃孵箱溫育30 min。孵畢，置生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以甲醇固定，瑞氏染色、鏡檢，計(jì)算吞噬百分率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100、吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BCG-PSN對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率的影響

裸鼠正常對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬百分率下降，與KM對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與裸鼠正常對(duì)照組相比，BCG-PSN高劑量組能顯著提高裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 藥物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率的影響（±s）

表1 藥物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率的影響（±s）

注：與KM空白對(duì)照組比較*P＜0.05；與裸鼠正常對(duì)照組比較#P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較△P＜0.01。

BCG-PSN高劑量組 12.5 42.40±6.55#△BCG-PSN中劑量組 6.25 38.00±4.19△BCG-PSN低劑量組 3.125 35.90±4.93裸鼠陽性對(duì)照組 0.5mL 31.67±4.87裸鼠正常對(duì)照組 0.5mL 35.22±5.65*KM空白對(duì)照組 0.5mL 40.50±5.17

2.2 BCG PSN對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率的影響

裸鼠正常對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)下降，與KM對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與裸鼠正常對(duì)照組相比，BCG-PSN高、中、低劑量組能明顯提高裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 藥物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響（±s）

表2 藥物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響（±s）

注：與KM空白對(duì)照組比較*P＜0.05；與裸鼠正常對(duì)照組比較#P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較△P＜0.01。

組別 給藥劑量（mg/kg）吞噬指數(shù)BCG-PSN高劑量組 12.5 0.74±0.14# △BCG-PSN中劑量組 6.25 0.76±0.12# △BCG-PSN低劑量組 3.125 0.72±0.11#裸鼠陽性對(duì)照組 0.5 0.58±0.14裸鼠正常對(duì)照組 0.5 0.53±0.08*KM空白對(duì)照組 0.5 0.64±0.09

3 討論

BCG-PSN系經(jīng)熱酚法從滅活的卡介菌提取而來，主要成分包括脂多糖和核酸。關(guān)于BCG-PSN的作用機(jī)理，通常認(rèn)為可能是：通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞免疫、體液免疫、刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活單核 巨噬細(xì)胞功能，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞功能來增強(qiáng)機(jī)體抗病能力；通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞，封閉IgE功能，減少脫顆粒細(xì)胞釋放活性物質(zhì)，以及抗乙酰膽堿所致的支氣管痙攣?zhàn)饔?，達(dá)到抗過敏功能；增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的自然細(xì)胞毒效和誘導(dǎo)干擾素形成，因而還具有增強(qiáng)抗感染和抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

巨噬細(xì)胞是一類參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞，在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和免疫應(yīng)答過程中起著重要作用[1-2]。巨噬細(xì)胞的主要功能有：直接吞噬和殺滅多種病原微生物；加工和遞呈抗原，激活特異性免疫反應(yīng)；合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[3]。巨噬細(xì)胞不僅參與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)與非特異性免疫反應(yīng)，而且還是兩種免疫反應(yīng)建立相互聯(lián)系的“橋梁細(xì)胞”，并作為效應(yīng)細(xì)胞起作用。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，它具有吞噬、加工和處理抗原物質(zhì)，并把抗原傳遞給淋巴細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗體或淋巴因子，加強(qiáng)殺傷靶細(xì)胞的能力。其吞噬功能不僅是免疫系統(tǒng)維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段，也是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，大多數(shù)抗原經(jīng)巨噬細(xì)胞處理后，免疫原性都大大增加。

裸鼠是隨著近代醫(yī)學(xué)發(fā)展，特別是免疫學(xué)和腫瘤學(xué)研究的需要，在近十幾年中發(fā)展起來的動(dòng)物模型。它是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，是由于第Ⅶ連鎖群內(nèi)裸體位點(diǎn)的等位基因發(fā)生純合而形成的突變小鼠新品種。裸鼠由于無胸腺，因此缺乏免疫反應(yīng)，是免疫缺陷動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)以BALB/c裸鼠作為免疫抑制小鼠模型，裸鼠正常對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率及吞噬指數(shù)均比KM空白對(duì)照組顯著降低，可認(rèn)為裸鼠的免疫能力低于正常小鼠；而BCGPSN高劑量組能顯著提高裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率，BCG-PSN高、中、低劑量組均能顯著提高裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，說明BCG-PSN能夠增強(qiáng)裸鼠的吞噬功能，通過增強(qiáng)其表達(dá)提高裸鼠的免疫功能。本研究結(jié)果提示BCG-PSN有較好的免疫增強(qiáng)作用，其研究結(jié)果為臨床進(jìn)一步用藥奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]何 慧,潘育芳.甘露聚糖肽片對(duì)小鼠單核吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2006,12(11):12-13.

[2]李淑蓮,付 克,劉睿姝.柴芩清肝膠囊對(duì)小鼠單核吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].中醫(yī)藥信息,2009,26(1):88.

[3]Nomura M,Kaji A,Ma W,et al.Suppression of cell transformation and induction of apoptosis by caffeic acid phenethyl ester[J].Mol Careinog,2001,1(2):83-93.