陳育華，吳國(guó)才，王 珍，周碧云

1)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科湛江524001 2)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科湛江524001 3)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心四區(qū)湛江524001

目前對(duì)于鼻咽癌的治療仍以放療輔助化療為主，但不管是針對(duì)原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶的放化療，都不可避免地存在一定的毒副作用，因此，尋找一種高效低毒的抗鼻咽癌藥物尤為重要。山奈酚主要是從姜科植物山奈根莖中提取的一種黃酮類化合物，能抑制食管癌細(xì)胞、類淋巴母細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［1-2］。該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能抑制人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但作用機(jī)制尚不清楚。作者進(jìn)一步觀察了山奈酚對(duì)CNE-2細(xì)胞周期及相關(guān)調(diào)控基因CyclinB1、Cdk1表達(dá)的影響，以期闡明山奈酚抗鼻咽癌的作用機(jī)制，為鼻咽癌治療藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 山奈酚購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成50 mmol/L的母液，－20℃保存，臨用前用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)的濃度備用。CNE-2細(xì)胞由廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所傳代并保存。2.5 g/L胰蛋白酶、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、PI、RNase A為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;總RNA抽提試劑盒及RT-PCR反應(yīng)試劑盒為QIAGEN Germany公司產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 山奈酚處理后CNE-2細(xì)胞活力的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2細(xì)胞消化并制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 5.0 ×104mL－1，按每孔 100 μL 接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后吸除全部培養(yǎng)液，分別換上含 0(對(duì)照)、20、40、60、80、100 μmol/L 山奈酚的培養(yǎng)液在孵箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每個(gè)條件下設(shè)5個(gè)復(fù)孔。然后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄各培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，加入DMSO 200 μL，充分振蕩搖勻后以570 nm為測(cè)定波長(zhǎng)、630 nm為參比波長(zhǎng)，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)各孔吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)孔平均A值/對(duì)照孔平均A值×100%。

1.3 山奈酚處理后CNE-2細(xì)胞周期的測(cè)定 按1.2接種CNE-2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后吸除全部培養(yǎng)液，分別換含 0、20、40、60、80、100 μmol/L山奈酚的培養(yǎng)液，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃分別培養(yǎng)24和48 h。然后，經(jīng)PI染液(含50 mg/L PI，10 mg/L Rnase A，體積分?jǐn)?shù) 0.1%Triton X-100，1 g/L檸檬酸鈉和生理鹽水)懸浮細(xì)胞，4℃避光染色30 min，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上Epics-XL型(美國(guó))流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 山奈酚處理后 CNE-2細(xì)胞 CyclinB1、Cdk1 mRNA的表達(dá) 收獲經(jīng)不同濃度山奈酚處理24 h的CNE-2細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板，進(jìn)行PCR。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。CyclinB1上游引物序列:5’-GCAAC CTCCAAGCCCGGACTG-3’，下游引物序列:5’-AAATAGGCTCAGGCGAAAGTT-3’，產(chǎn)物大小為265 bp;Cdk1上游引物序列:5’-CTGGGGTCAGCTCGT TACTCA-3’，下游引物序列:5’-TTTGGGAAATG TATTCTTATA-3’，產(chǎn)物大小為 204 bp;β-actin 上游引物序列:5’-AACGGCTCCGGCATGTGCAAG-3’，下游引物序列:5’-CACAGCCTGGATAGCAACGTA-3’，產(chǎn)物大小為384 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃(CyclinB1和β-actin)或50℃(Cdk1)退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后再72℃繼續(xù)延伸5 min。取目的產(chǎn)物6 μL，瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶顯色，用紫外燈觀察并拍照，用Quantity one軟件進(jìn)行條帶光密度測(cè)定，以目的基因與β-actin條帶光密度的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，采用6×3析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)細(xì)胞周期及CyclinB1、Cdk1 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 山奈酚處理后CNE-2細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。

2.2 山奈酚處理后CNE-2細(xì)胞周期的變化 見(jiàn)表2、表 3。

2.3 山奈酚處理后CNE-2細(xì)胞CyclinB1及Cdk1 mRNA的表達(dá) 見(jiàn)圖1、表4。

表2 山奈酚處理24 h后CNE-2細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果(n=3)%

表3 山奈酚處理48 h后CNE-2細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果(n=3)%

圖1 山奈酚對(duì)CNE-2胞CyclinB1及Cdk1 mRNA表達(dá)的影響

表4 山奈酚處理24 h后CNE-2細(xì)胞CyclinB1及Cdk1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

3 討論

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖及凋亡失衡有關(guān)，而細(xì)胞周期的調(diào)控在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山奈酚能顯著抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。山奈酚作用后CNE-2細(xì)胞G0/G1期比例降低，S期及G2/M期比例增加，說(shuō)明山奈酚可使CNE-2細(xì)胞DNA合成增加，但阻止其分裂，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，使之無(wú)法完成有絲分裂，從而抑制其增殖活性。這與山奈酚能使人食管鱗癌細(xì)胞株 KYSE-510［3］、人宮頸癌 HeLa 細(xì)胞［4］發(fā)生G2/M期阻滯的報(bào)道相一致。

細(xì)胞周期有 G0/G1、G1/S、G2/M 3個(gè)調(diào)控點(diǎn)，其調(diào)控因子包括細(xì)胞周期素(Cyclin)、周期素依賴性激酶(CDK)和周期素依賴性激酶抑制劑(CDKI)。在所有參與M期調(diào)控的激酶中，Cdk1是最重要的，它與CyclinB1形成復(fù)合物CyclinB1/Cdk1，控制真核細(xì)胞從G2到M期的移行過(guò)程。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20～100 μmol/L山奈酚作用 24 h后，CNE-2細(xì)胞CyclinB1及Cdk1 mRNA的表達(dá)均隨山奈酚濃度的增加而下降，兩者的變化趨勢(shì)相似。提示山奈酚能通過(guò)下調(diào) CyclinB1及 Cdk1的轉(zhuǎn)錄水平而阻滯CNE-2細(xì)胞于G2/M期。目前有關(guān)黃酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞CyclinB1及Cdk1表達(dá)的影響有不同報(bào)道。Xu等［4］研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能以非p53依賴的方式誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，在mRNA及蛋白水平下調(diào)CyclinB1及 Cdk1的表達(dá)。而另一些學(xué)者研究［5］發(fā)現(xiàn)槲皮素能使人白血病細(xì)胞阻滯于G2/M期，這與Cyclin B1及p21(Cip1)在細(xì)胞內(nèi)的大量積累以及 Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、MPM-2磷酸化狀態(tài)的改變有關(guān)。在人乳癌SK-BR-3細(xì)胞，芹菜(苷)能誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞的積累，從而導(dǎo)致Cdc2、Cyclin A 及 Cyclin B 蛋白表達(dá)的下調(diào)［6］。而 Li等［7］發(fā)現(xiàn)槲皮素(大于 40 μmol/L)既可以通過(guò)降低CyclinB1蛋白表達(dá)將結(jié)腸癌細(xì)胞SW480阻滯在G2/M期，又可以通過(guò)增強(qiáng)CyclinB1的表達(dá)以及增加CDC2激酶的活性將肺癌細(xì)胞株NCI-H209周期阻滯于G2/M期?？梢?jiàn)黃酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞CyclinB1/Cdk1復(fù)合物的影響因黃酮類化合物種類及其作用的腫瘤細(xì)胞類型不同而不同。

綜上所述，山奈酚通過(guò)下調(diào) CyclinB1及Cdk1 mRNA的表達(dá)水平，阻滯CNE-2細(xì)胞于G2/M期，這可能是山奈酚抑制CNE-2細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，但能否在蛋白水平也下調(diào)CyclinB1及Cdk1的表達(dá)以及山奈酚對(duì)Cdk1的磷酸化程度影響如何仍有待進(jìn)一步研究。

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