劉秀明，朱海林，杜淑環(huán)，萬 秋，李海燕，李校堃

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長春130118;2溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州325035;3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118)

抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用挽救了許多被致病菌感染的人，然而，隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用導(dǎo)致臨床耐藥株日益增多，從而使許多抗生素逐漸失去臨床應(yīng)用的價(jià)值.因此，尋找新一代的抗菌藥已成為現(xiàn)時(shí)一項(xiàng)迫切的任務(wù).抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是廣泛存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害的一類小分子多肽，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分.與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有相對分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性、對真核細(xì)胞毒性作用低、有一定抑制某些惡性腫瘤作用等特點(diǎn)，顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景［1］.天蠶素AD(Cecropin AD，CAD)基因是人工合成的由Cecropin A的N端1～11肽段和Cecropin D的C端12～37肽段組成的雜合肽.據(jù)測定，化學(xué)合成的抗菌肽AD，其殺菌活性和抗菌譜都明顯高于天然抗菌肽(殺菌活性是Cecropin D的5～55倍，對枯草桿菌Bacillus subtilis的活性是 Cecropin A 的6倍)［2-3］.植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白有如下優(yōu)點(diǎn):1)植物細(xì)胞具有全能性;2)真核表達(dá)系統(tǒng)能正確表達(dá)和加工［4］;3)生產(chǎn)成本低;4)存儲(chǔ)、使用簡單方便［5］;5)使用安全.紫花苜蓿Medicago sativa是世界上最重要的飼料作物之一，具有抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，利用年限長，再生性強(qiáng)的特點(diǎn).另外，紫花苜蓿具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性和穩(wěn)定的生產(chǎn)力，每年可以收獲多次，而且由于本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以適宜作生物反應(yīng)器.本研究利用根癌農(nóng)桿菌LBA4404將CAD基因?qū)胱匣ㄜ俎?，成功得到了表達(dá)，并且表達(dá)的蛋白具有一定的抑菌活性.對利用紫花苜蓿作為植物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌肽的研究有一定的意義.

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

根瘤農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens菌種LBA4404(含Ti輔助質(zhì)粒)、大腸埃希菌 Escherichia coil菌株DH5α、質(zhì)粒pCAMBIA1390R等由生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心提供.

1.2 酶及化學(xué)試劑

內(nèi)切酶、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、PCR回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自TaKaRa公司;植物DNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司、RNA抽提試劑盒購自捷瑞生物有限公司、通用型RT-PCR試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;地高辛標(biāo)記試劑盒購自ROCHE(Cat.No.11 745 832 910).

1.3 CAD基因的合成

根據(jù)GenBank上登錄的Cecropin A和Cecropin D序列設(shè)計(jì)CAD堿基序列，按照植物偏好密碼子將CAD堿基序列重新改造，根據(jù)密碼子的簡并性消除在試驗(yàn)中用到的酶切位點(diǎn)，并且引入對外源基因表達(dá)有促進(jìn)作用的調(diào)控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列.應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)合成正向引物:ADP1、ADP2、ADP3，反向引物:ADP4、ADP5、ADP6(表 1)，并在基因兩端引入 KpnⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基.采用基因重疊延伸拼 接 方 法［6］(Gene splicing by overlap extension，SOE)合成全長CAD基因(圖1).

表1 設(shè)計(jì)并合成的引物序列Tab.1 Primer sequences of designing

1.4 CAD基因中間克隆載體的構(gòu)建及測序

合成的CAD基因片段通過8 g/L瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下檢測目的產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒純化回收.將回收產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ酶切，用PCR純化回收試劑盒回收目的片段.將目的基因片段與經(jīng)相同酶切回收的pUC19大片段連接命名為pUC19CAD.反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性克隆菌進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的單菌落搖菌后保存菌種并測序，測序工作由上海生工生物工程服務(wù)有限公司完成.

1.5 植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390RCAD構(gòu)建

將測序正確的pUC19CAD和pCAMBIA1390R分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ進(jìn)行酶切，回收小片段CAD和大片段pCAMBIA1390R，連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，通過菌落PCR篩選陽性克隆菌，搖菌并保種，命名為pCAMBIA1390RCAD(圖2).提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390RCAD用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404制備工程菌.用PCR法對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定所得陽性單菌落為含目的基因的工程菌株.

圖1 PCR方法合成CAD基因全長策略圖Fig.1 Strategy to synthesize CAD gene by overlapping extension method of PCR

1.6 紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化

將在種子培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L)上培養(yǎng)5～7 d的紫花苜蓿無菌苗子葉剪成0.3～0.5 cm小段;用含pCAMBIA1390RCAD農(nóng)桿菌LBA4404(D600nm=0.5～0.6)浸染5～8 min，吸去外植體表面殘余菌液，置共培養(yǎng)基(TM-1+2，4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ 瓊脂6 g/L+蔗糖30 g/L)上共培養(yǎng)3 d(25℃黑暗條件);轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(TM-1+2，4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Tim 300 mg/L+Hyg 20 mg/L+瓊脂6 g/L+蔗糖30 g/L)進(jìn)行篩選，每2周繼代1次誘導(dǎo)胚性愈傷組織;待組織有綠色的芽點(diǎn)出現(xiàn)，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+Tim 300 mg/L+Hyg 20 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖10 g/L)上繼續(xù)培養(yǎng)，每2周繼代1次，待芽長至3～5 cm高時(shí)，將其從外植體上分離開，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+Hyg 20 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖10 g/L)中繼續(xù)伸長及生根.培養(yǎng)溫度25～26℃，每天光照16 h.3～4周后待根系發(fā)達(dá)后，打開瓶蓋，煉苗2～3 d，移栽到滅菌的土中繼續(xù)培養(yǎng).

圖2 植物表達(dá)載體pCAMBIA1390RCAD結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structure of plant expression plasmid pCAMBIA1390RCAD

1.7 紫花苜蓿抗性植株的PCR檢測

取潮霉素抗性苗和未轉(zhuǎn)基因植株新鮮葉片各100 mg，置于液氮中研磨成細(xì)粉，按照植物基因組DNA提取試劑盒操作方法提取總DNA.取1μL總DNA為模板，用CAD基因上游引物ADP1和下游引物ADP6為引物，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，以表達(dá)載體pCAMBIA1390RCAD為陽性對照，對基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測.反應(yīng)體系為:2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，模板 DNA 1 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol/μL)，加 ddH2O 至 20 μL.擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán);72℃后延伸3 min.通過8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下分析擴(kuò)增的DNA片段.

1.8 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的 Southern blotting分析

取PCR檢測為陽性的紫花苜蓿植株葉片4 g，用CTAB法［7］提取苜?；蚪MDNA.每個(gè)苜蓿植株樣品取40～50 μg基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ酶切過夜.將酶切好的基因組樣品用8 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使片段按照分子大小分開，用堿變性法處理凝膠后，再利用毛細(xì)轉(zhuǎn)移法將酶切后的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上.根據(jù) DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒制備探針(TTTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAAC;TTACAACTCATCCTTGTTCTTAGCAAGAGCAGTAGCCTG)，42℃進(jìn)行雜交過夜，顯色，分析雜交信號(hào).

1.9 CAD轉(zhuǎn)基因植株體外抗菌活性鑒定

將沙門氏菌Salmonella及金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus單克隆培養(yǎng)過夜，搖至D600nm為0.4～0.6后，取100 μL均勻涂布于無抗生素的固體LB平板上，涂布均勻無液體后，在板上放入裁剪好的圓型濾紙，在其上加入20 μL蛋白樣品.待加入的液體被吸收之后，將平板正置于37℃培養(yǎng)箱中，過夜.

2 結(jié)果與分析

2.1 CAD基因的克隆及測定

利用PCR搭橋法合成CAD全長基因，得到長度為229 bp的基因片段(圖3A)，與預(yù)期一致.將目的基因片段與測序載體 pUC19連接并轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性克隆菌進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖3B)，PCR鑒定為陽性的菌落測序結(jié)果與預(yù)期一致.

2.2 植物雙元表達(dá)載體 pCAMBIA1390RCAD的構(gòu)建

將CAD基因定向插入pCAMBIA1390R載體中，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1390RCAD，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ酶切得到了229 bp的目的片段和載體大片段(圖4).結(jié)果與預(yù)期一致，表明CAD基因已經(jīng)整合進(jìn)了重組質(zhì)粒中.

圖3 CAD全長基因及其克隆菌的PCR鑒定Fig.3 PCR amplification of CAD gene and identification of colony

圖4 重組質(zhì)粒pCAMBIA1390RCAD的酶切鑒定Fig.4 Restriction digestion analysis of recombinant plasmid pCAMBIA1390RCAD

2.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

利用凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1390RCAD轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，用菌落PCR法對陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增得到大小為229bp左右的CAD基因(圖5)，說明挑取的農(nóng)桿菌可以用于下一步紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化.

2.4 紫花苜蓿陽性植株的PCR鑒定

挑選潮霉素抗性植株，提取基因組DNA，非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對照，重組質(zhì)粒pCAMBIA1390RCAD為陽性對照，以ADP1和ADP6為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示有目的條帶出現(xiàn)(圖6)，表明CAD已整合進(jìn)苜?；蚪M.

圖5 農(nóng)桿菌陽性克隆Fig.5 Screen of positive transformants of Agrobacterium tumefaciens

圖6 轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的PCR檢測Fig.6 Identification of transgenic plants by PCR amplification

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blotting分析

對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blotting分析(圖7).結(jié)果顯示有4株出現(xiàn)雜交信號(hào)，而非轉(zhuǎn)基因植株沒有出現(xiàn)雜交信號(hào).由此可以說明，目的基因CAD已經(jīng)成功地整合進(jìn)苜蓿基因組中.

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的體外抗菌活性鑒定

對從轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片中提取的總蛋白的抑菌活性進(jìn)行了分析，選取2種不同的指示菌，即沙門氏菌和金黃色葡萄球菌.結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因苜蓿對測試菌有抑菌圈出現(xiàn)，而野生型苜蓿沒有抑菌圈(圖8).

圖7 轉(zhuǎn)基因苜蓿植株Southern blotting分析Fig.7 Identification of the transgenic plants by Southern hybridization

圖8 瓊脂糖擴(kuò)散法測抑菌活性Fig.8 Results of agarose diffusion assay

3 討論

近年來，很多研究證實(shí)植物表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)活性外源蛋白的能力，無論是在產(chǎn)品質(zhì)量、成本和安全性等各方面都顯現(xiàn)出巨大優(yōu)勢［8］.但是，作為一種新型的表達(dá)系統(tǒng)，如何提高蛋白表達(dá)量，減少錯(cuò)誤蛋白的修飾以及降低下游分離純化成本等問題是所有研究者共同面對的問題.

起始位點(diǎn)上游的調(diào)節(jié)序列，也對轉(zhuǎn)錄的效率有很大的影響，如Ω序列等.有研究顯示在煙草和水稻中，以CaMV35S為啟動(dòng)子，插入Ω序列和內(nèi)含子序列，使GUS基因的活性提高20～70倍［9］.所以本試驗(yàn)在合成基因時(shí)在起始位點(diǎn)上游引入了Ω序列和Kozak序列.

為了提高外源蛋白的表達(dá)量，本試驗(yàn)在抗菌肽的C端引入了KDEL序列.研究表明，蛋白質(zhì)C端的KDEL序列能將蛋白質(zhì)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通過改變蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位和分泌途徑，能明顯地提高外源蛋白在宿主體內(nèi)的表達(dá)水平［10-11］.

本研究利用植物生物反應(yīng)器表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CAD基因，經(jīng)PCR檢測、Southern blot檢測和抑菌活性檢測，結(jié)果表明:根癌農(nóng)桿菌能夠成功介導(dǎo)CAD基因，整合到陽性紫花苜蓿轉(zhuǎn)化株的基因組中，抑菌活性結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因苜蓿具有一定的抑菌活性.本試驗(yàn)將CAD基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ校蔀榻窈罄蒙锓磻?yīng)器表達(dá)系統(tǒng)在植物中生產(chǎn)藥用蛋白的工程化提供參考.

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