郝堂娜，孫 玲，李 鎮(zhèn)，張 寧，張 策，聶維廷

他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)是日本藤澤研發(fā)的23元環(huán)狀大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，通過拮抗相關(guān)多細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)來抑制T細(xì)胞活化［1-2］，具有急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低、對(duì)類固醇激素相對(duì)無依賴性等優(yōu)點(diǎn)。但其治療窗窄，生物利用度個(gè)體差異大，同時(shí)存在很多不良反應(yīng)［3-4］，因此，對(duì)FK506進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)非常必要［5-6］。本文采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行血藥濃度測(cè)定，并對(duì)2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)過程中的隨行質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，確保他克莫司血藥濃度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 PRO-TracⅡTMTacrolimus ELISA試劑盒(美國 Diasorin公司生產(chǎn)):①酶標(biāo)板;②FK506單克隆抗體;③5×濃縮辣根過氧化酶儲(chǔ)存液;④酶標(biāo)稀釋液;⑤標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為:0.3、1.0、3.0、10、30 ng/mL);⑥低、高質(zhì)控對(duì)照品1、2;⑦底物液;⑧終止液;⑨10×洗滌液;⑩消化液。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(美國Universal Microplae Reader EL×800NB)，Adoff管(江蘇海門天星塑料制品廠)，HH-W21-420S數(shù)顯電熱顯溫水溫箱，SK-1快速混勻器(江蘇醫(yī)療儀器廠)，LG15-W 離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，他克莫司定量測(cè)定試劑盒(酶聯(lián)免疫法，美國Diasorin公司)，低速自動(dòng)平衡離心機(jī) LDZ5-2(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，Stat Fax-2200孵育振蕩儀(美國Awareness公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 建立5個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo) 準(zhǔn) 品 濃 度 分 別 為 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 ng/mL，并隨行兩個(gè)濃度質(zhì)控樣品 2.0、15.0 ng/mL。取標(biāo)準(zhǔn)系列樣品、質(zhì)控對(duì)照樣品各25μL放入1.5mL Adoff管，加入150μL 消化液，渦旋30 s，室溫下靜置15min，然后放入75℃水浴箱中靜置15min。取出渦旋30 s，4500 r/min離心10min，分別取上清液100μL加入酶標(biāo)板，除空白對(duì)照管外，每管加50μL FK506單抗，空白對(duì)照管加50μL酶標(biāo)稀釋液，用薄膜覆蓋酶標(biāo)板放入溫育震蕩器，(700±50)r/min置37℃震蕩30min。取出加酶標(biāo)液50μL(用酶標(biāo)稀釋液5倍稀釋酶標(biāo)濃縮液)，震蕩60min(條件同前)。取出洗板3次(用蒸餾水將洗滌緩沖液按1∶10稀釋)，然后每管加200μL底物液，震蕩15min(條件同前)。再加入100μL終止液，在450/630 nm下測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制吸光度對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。

2.2 FK506質(zhì)控樣品血藥濃度測(cè)定 監(jiān)測(cè)全血中FK506血藥濃度，同時(shí)監(jiān)測(cè)低、高兩個(gè)質(zhì)控樣本濃度 C1、C2(ng/mL)，測(cè)定方法同“2.1”項(xiàng)方法。

2.3 數(shù)據(jù)分析方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別對(duì)2007年6月-2010年7月期間的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制質(zhì)控曲線。

2.4 繪制質(zhì)控圖和設(shè)定控制限 在監(jiān)測(cè)臨床樣品血藥濃度同時(shí)隨行質(zhì)控測(cè)定，并記錄結(jié)果。以2007年6月-2010年7月監(jiān)測(cè)質(zhì)控的單次測(cè)定結(jié)果為研究對(duì)象，對(duì)獲得的FK506低、高濃度質(zhì)控測(cè)定結(jié)果C1、C2(ng/mL)進(jìn)行回顧性分析，計(jì)算出平均值(X)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。以X為靶值，SD的倍數(shù)為控制限，即質(zhì)控品測(cè)定值在X±2SD之間為質(zhì)控結(jié)果在控，以X±2SD為警告限、X±3SD為失控限。以靶值為中心線，以測(cè)定批次為橫坐標(biāo)，以濃度測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)，標(biāo)出各條控制限，繪制FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)的Levey-Jennings質(zhì)控圖。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=1.9668/［1+(X/3.697)^1.381］+0.4602，r=0.9996，如圖1 所示。FK506在0.3～30μg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定FK506標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 對(duì)2007年6月-2010年7月隨行低、高質(zhì)控的單次測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行單向方差檢驗(yàn)。結(jié)果表明，在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)低質(zhì)控的測(cè)定結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對(duì)高質(zhì)控的測(cè)定差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表1。

表1 2007年6月-2010年7月高、低質(zhì)控處理結(jié)果

3.3 levey-Jennings質(zhì)控圖分析結(jié)果 2007年6月-2010年 7月測(cè)得質(zhì)控 269份，其中 C1(2.0 ng/mL)134份，C2(15 ng/mL)135份，質(zhì)控周期內(nèi)隨行質(zhì)控樣本RSD分別為3.85%、4.89%、4.80%。繪制單濃度Levey-Jelmings質(zhì)量控制圖，測(cè)定結(jié)果均“在控”，結(jié)果見表2。低濃度質(zhì)控誤差允許范圍(X±2SD)為1.15～3.29 ng/mL，測(cè)定值范圍為1.72～2.63 ng/mL，而高濃度質(zhì)控誤差允許范圍(X±2SD)為10.50～21.55 ng/mL，測(cè)定值范圍為13.92～17.10 ng/mL，可見高、低質(zhì)控均在質(zhì)控警告限范圍內(nèi)，結(jié)果見圖2、圖3。

表2 Levey-Jelmings質(zhì)控圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控范圍結(jié)果比較

圖2 質(zhì)控C1(ng/mL)濃度Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖3 質(zhì)控C2(ng/mL)濃度Levey-Jennings質(zhì)控圖

4 討論

4.1 FK506藥物濃度監(jiān)測(cè)方法的選擇 FK506在全血中分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血漿，因此，測(cè)定FK506全血血藥濃度檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果更可靠。目前，F(xiàn)K506全血血藥濃度測(cè)定的常用方法有ELISA、微粒酶免疫分析法(MEIA)、高效液相色譜法(HPLC)法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)法和酶增強(qiáng)免疫分析法(EMIT)［8］。本試驗(yàn)選擇ELISA法，其靈敏度高，特異性好，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，結(jié)果易判斷。試劑盒附帶標(biāo)準(zhǔn)品和低、高兩個(gè)質(zhì)控品，測(cè)定時(shí)只需滿足低、高質(zhì)控樣品“在控”，即可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管質(zhì)控允許的誤差范圍比一般TDM質(zhì)控允許誤差范圍大，但由于其測(cè)定過程中試驗(yàn)步驟多、周期長，測(cè)定人員不固定，測(cè)定結(jié)果易受溫度等外界因素干擾，所以，儀器的維護(hù)和校準(zhǔn)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提。此外，試劑盒、質(zhì)控盒、標(biāo)準(zhǔn)曲線盒應(yīng)置于冰箱保存，無變質(zhì)、過期，從而保證為臨床提供準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，以制定合理的個(gè)體化給藥方案。

4.2 FK506藥物濃度監(jiān)測(cè)隨行質(zhì)控分析 目前，常規(guī)FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制采用定期或每次測(cè)定樣本時(shí)隨行測(cè)定質(zhì)控樣本，只要質(zhì)控樣本的測(cè)定結(jié)果落在說明書允許的誤差范圍內(nèi)，則判斷此測(cè)定結(jié)果可靠［9］。這種判斷標(biāo)準(zhǔn)忽略了評(píng)價(jià)的連續(xù)性，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)影響測(cè)定準(zhǔn)確性的潛在因素。此外，也有采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件質(zhì)控程序，其主要用于處理每日多點(diǎn)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理有一定局限性。本試驗(yàn)采用室內(nèi)單值質(zhì)控法，即Levey-Jennings質(zhì)控法，通過回顧性計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以X±2S為警告限，以X±3S為失控限，繪制指控圖。每次僅需監(jiān)測(cè)一次質(zhì)控樣品，用室內(nèi)質(zhì)控圖對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果可靠性進(jìn)行判斷，即室內(nèi)質(zhì)控“失控”時(shí)未查明原因前監(jiān)測(cè)結(jié)果不宜發(fā)出，室內(nèi)質(zhì)控“在控”時(shí)，方可發(fā)出監(jiān)測(cè)結(jié)果［10］。在實(shí)際監(jiān)測(cè)中及時(shí)繪制質(zhì)控圖，根據(jù)質(zhì)控圖對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果加以判斷。若質(zhì)控測(cè)定存在漂移、趨勢(shì)性變化，則立即分析出現(xiàn)這種定向趨勢(shì)的原因，排查誤差并分析可能存在的影響因素并及時(shí)糾正，以確保提供準(zhǔn)確可靠的血藥濃度測(cè)定結(jié)果。本文回顧分析了近2年的質(zhì)控監(jiān)測(cè)結(jié)果，通過繪制質(zhì)控圖，發(fā)現(xiàn)低、高質(zhì)控結(jié)果均在警告限范圍內(nèi)，且在中心線兩側(cè)規(guī)律波動(dòng)，未出現(xiàn)定向改變的趨勢(shì)，表明每次的TDM監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有臨床指導(dǎo)意義。

5 小結(jié)

本文對(duì)2007年6月-2010年7月FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)過程中的隨行質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析，對(duì)其進(jìn)行單向方差分析，繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖。結(jié)果表明，2007年6月-2010年7月隨行的質(zhì)控分析結(jié)果均“在控”，質(zhì)控結(jié)果均在誤差允許范圍內(nèi)，說明FK506血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)可靠，準(zhǔn)確度高，具有較好的臨床指導(dǎo)意義。

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