楊 慧，魏解冰，阮 穎，劉春林*

(1作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長(zhǎng)沙410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院;3湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

神經(jīng)酸，化學(xué)名為順－15－二十四碳烯酸(24:1)，是一種超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸(VLCMFA)，存在于蒜頭果、碎米薺、銀扇草、大麻、雞爪槭、旱金蓮、遏藍(lán)菜、盾葉木、元寶楓等植物的種子油中［1，2］。有研究表明，神經(jīng)酸是大腦神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)組織的核心天然成分，是迄今為止世界上發(fā)現(xiàn)的能促進(jìn)受損神經(jīng)組織修復(fù)和再生的特效物質(zhì)，是神經(jīng)細(xì)胞特別是大腦細(xì)胞、視神經(jīng)細(xì)胞、周?chē)窠?jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、再發(fā)育和維持的“必需高級(jí)營(yíng)養(yǎng)素”，對(duì)提高腦神經(jīng)的活躍程度，防止腦神經(jīng)衰老有很大作用［3］。但人體自身很難生成神經(jīng)酸，只能靠體外攝取來(lái)補(bǔ)充。目前人們正致力于生產(chǎn)天然的神經(jīng)酸油用于醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)制品和工業(yè)應(yīng)用。自然界中含神經(jīng)酸植物的果實(shí)含油量、神經(jīng)酸含量差異較大，開(kāi)發(fā)成本高，要開(kāi)發(fā)神經(jīng)酸產(chǎn)品，需要低成本地獲得天然高含神經(jīng)酸的資源。

神經(jīng)酸的合成過(guò)程主要涉及到β－酮脂酰－CoA合酶(3－ketoacyl－CoA synthase，KCS)、β－酮脂酰－CoA還原酶 (3－ketoacyl－CoA reductase，KCR)、β－羥脂酰－CoA脫水酶(3－h(huán)ydroxacyl－CoA dehydratase，HCD)和反式烯脂酰－CoA還原酶(trans－2，3－enoyl－CoA reductase，ECR)，這4種酶協(xié)同作用形成功能復(fù)合體，稱(chēng)為脂肪酸延長(zhǎng)酶［4］。其中β－酮脂酰－CoA合酶又稱(chēng)為脂肪酸延長(zhǎng)酶1(Fae1)或簡(jiǎn)稱(chēng)KCS。有研究顯示，雖然所有植物及微生物體的脂肪酸延長(zhǎng)酶系統(tǒng)中都普遍存在著這4種酶，但除第一個(gè)酶β－酮脂酰－CoA合酶(KCS)起著關(guān)鍵作用外，其它3種酶的作用處于次要地位，因此KCS酶的活性高低成為制約超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的重要因素［5］，是超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成反應(yīng)的限速酶［6］。目前許多低芥酸油菜品種的育種原理都是通過(guò)該酶的突變完成的。Millar和Kunst在酵母中成功地利用強(qiáng)半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)了擬南芥的fae1基因，并且在轉(zhuǎn)化株中積累了20:1，22:1以及24:1這些在非轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)物中不存在的脂肪酸［7］。Fae1基因是β－酮脂酰－CoA合酶的編碼基因，也是控制芥酸等超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵基因［8］。Elzbieta Mietkiewska等人克隆了銀扇草的KCS基因，將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，種子油脂肪酸成分分析表明神經(jīng)酸的含量增長(zhǎng)了30倍，轉(zhuǎn)入埃塞俄比亞芥也使其種子油中神經(jīng)酸含量增長(zhǎng)了7至10 倍［9］。GenBank 中 尚 無(wú) 碎 米 薺 (Cardamine hirsuta L.)KCS基因cDNA序列的記錄。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)KCS基因的保守性，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR克隆神經(jīng)酸含量較高的碎米薺的KCS基因，并將其連接到種子特異性啟動(dòng)子NapinA上，構(gòu)建成過(guò)表達(dá)載體，用來(lái)轉(zhuǎn)化高芥酸含量的甘藍(lán)型油菜，希望通過(guò)生產(chǎn)油菜來(lái)獲得神經(jīng)酸產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種

碎米薺，采于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)路旁;高芥酸含量的甘藍(lán)型油菜品種GX－29，為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝調(diào)控研究組提供。

1.1.2 菌株

DH5α，LBA4404，為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝調(diào)控研究組保存。

1.1.3 載體與質(zhì)粒

pMD19－T載體購(gòu)自 TaKaRa公司。pFGC－5941.nap［10］表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室以NapinA啟動(dòng)子置換pFGC－5941質(zhì)粒35S啟動(dòng)子改造而成。

1.1.4 分子生物學(xué)試劑

TaqTMDNA聚合酶購(gòu)自東盛生物;LongAmp TaqDNA Polymerase購(gòu)自BioLabs公司;限制性?xún)?nèi)切酶，DNA T4 Ligation Kit購(gòu)自晶美公司;質(zhì)粒DNA小量純化 Kit，DNA凝膠回收 kit購(gòu)自安比奧公司;DNA Marker購(gòu)自北京天根;CTAB，Tris base，EDTA均購(gòu)自歐邁生物;瓊脂糖:西班牙產(chǎn);酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID.L TD;抗生素購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心。

1.2 方法

1.2.1 碎米薺總DNA的制備

以碎米薺幼葉為材料，參照CTAB法制備［11］。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及目的基因的全長(zhǎng)CDS克隆

登陸 NCBI網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，未找到碎米薺KCS基因的相關(guān)信息，但找到碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因mRNA全長(zhǎng)序列(EU871788)。下載后利用DNAS TAR軟件進(jìn)行序列編輯和分析，該KCS基因全序列，不含內(nèi)含子，總長(zhǎng)度為1 521 bp，共編碼506個(gè)氨基酸。而KCS基因在不同的種間都具有很大的保守性，因此可以根據(jù)該序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增碎米薺的KCS基因全序列。并根據(jù)質(zhì)粒載體pFGC5941.nap的限制性酶切位點(diǎn)，在正反向引物的5'端分別加入AscI和BamHI位點(diǎn)。引物由南京金斯瑞(Genscript)生物科技有限公司合成。引物序列如下:

KCSSF:5'－GGCGCGCCATGACGTCCATTAACG TAAAGCTC－3'

KCSSR:5'－GGATCCTTAGGACCGACCGTTT TGGGCA－3'

高保真LongAmp TaqDNA聚合酶PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s;70℃退火10 s;72℃延伸80 s;72℃延伸7 min;16℃保存。擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用安比奧公司DNA凝膠回收kit進(jìn)行回收純化后，連接到載體 pMD19－T構(gòu)建成T載體，命名為T(mén)－CarKCS。熱激法將此連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL涂到LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg/mL)上，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，重組子經(jīng)鑒定后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列的生物信息學(xué)分析

可在NCBI站點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)及結(jié)構(gòu)域分析，通過(guò) EXPASY的 ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析 CarKCS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，應(yīng)用SMART(http://smart.embl－h(huán)eidelberg.de/)在線(xiàn)預(yù)測(cè)CarKCS基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，用Clustal W軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，再用MEGA 4.1做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性?xún)?nèi)切酶AscI和 BamHI分別對(duì) TCarKCS載體和pFGC－5941.nap質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切得到的目的片段和載體均用凝膠回收kit回收，再按3∶1的連接體系進(jìn)行連接。將切下的TCarKCS片段插入pFGC－5941.nap質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成pNapin－CarKCS載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再涂布于 LB平板(含卡那霉素50 μg/mL)上篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆。按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR反應(yīng)及酶切驗(yàn)證獲得帶有目的基因的植物過(guò)表達(dá)載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的克隆和測(cè)序

根據(jù)合成引物的退火溫度，設(shè)計(jì)溫度梯度PCR，確定最佳的退火溫度為53℃，然后以53℃為退火溫度做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1。從電泳圖可以發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶大小約為1 500 bp，擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期的一致。回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD19－T載體上，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL涂布到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落做菌落PCR，如圖2所示。圖中4、5、7號(hào)泳道都為陽(yáng)性克隆，選取7號(hào)泳道的陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，去掉載體及酶切位點(diǎn)后擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1 518 bp。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast同源分析比對(duì)，此序列與碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因的mRNA全長(zhǎng)序列(EU871788)同源性達(dá)到88%。由此表明，所克隆的片段為CarKCS基因的全長(zhǎng)序列。

圖1 CarKCS目標(biāo)片段的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR test of CarKCS fragment

圖2 菌落PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of PCR test of colonies

2.2 序列及蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

將測(cè)序的CarKCS基因CDS序列在NCBI上進(jìn)行翻譯，發(fā)現(xiàn)該基因編碼505個(gè)氨基酸，不含內(nèi)含子，全長(zhǎng)為1 518 bp的完整開(kāi)放閱讀框，相對(duì)分子質(zhì)量為 56 346.0，等電點(diǎn)為 9.41。而碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因(EU871788)編碼506個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為56 465.1，等電點(diǎn)為9.25。進(jìn)一步將在NCBI上翻譯得到的氨基酸序列用SMART在線(xiàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果表明，其在第9至第31位氨基酸、第51至第70位氨基酸及第342至第364位氨基酸分別構(gòu)成了3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

許多科學(xué)家都對(duì)甘藍(lán)型油菜中KCS活性喪失的原因進(jìn)行了大量研究。Han等發(fā)現(xiàn)，在所有有功能的KCS蛋白中第282位氨基酸都為絲氨酸殘基，而無(wú)功能的蛋白在該位都為苯丙氨酸殘基［12］，CarKCS基因在第282位氨基酸都為絲氨酸殘基。Ghanevati等利用酵母表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行定點(diǎn)突變研究，還證實(shí)了 Cys223，His302，His387，His391 和His420都是組成β－酮酯酰－CoA合酶的活性位點(diǎn)的氨基酸殘基，這些氨基酸任何一個(gè)發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致酶活性的喪失［13，14］。

將CarKCS基因氨基酸序列與擬南芥中同源性最高的KCS18氨基酸序列進(jìn)行ClustalW分析，再用MEGA做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖譜如圖3，結(jié)果表明該基因有 Ser282，Cys223，His302，His387，His391 和 His420這些活性位點(diǎn)的氨基酸都存在，據(jù)此可以推測(cè)該基因具有正常的催化功能。

圖3 CarKCS與KCS18酶活性位點(diǎn)分析圖Fig.3 Analysis on enzyme active site between CarKCS and KCS18

2.3 CarKCS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

KCS基因家族主要存在于植物界，擬南芥脂基因數(shù)據(jù)庫(kù)中揭示了21個(gè)KCS相關(guān)基因的存在［15］。Lessire等人根據(jù)氨基酸序列同源性進(jìn)行ClustalW比對(duì)，可將其劃分為4個(gè)亞組:FAE1－like，KCS1－like，F(xiàn)DH － like，CER6 － like［16］。這些 KCS 基因存在組織、器官的特異性表達(dá)和底物特異性。它們對(duì)飽和的及單不飽和的C16和C18脂肪酰－CoA具有較高的活性，其中7個(gè)基因(FAE1，KCS1，KCS2，At5g43760，Atlg04220，CER60，At2g16280)在酵母中異源表達(dá)后可催化VLCEAs合成，不同程度的積累C20 ～C30 脂肪酸［17，18］。碎米薺與擬南芥同屬于十字花科植物，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Clustal W將CarKCS與擬南芥KCS基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CarKCS基因與KCS18的親緣關(guān)系最近，同屬于FAE1－like亞家族。

圖4 CarKCS與擬南芥KCS基因家族蛋白的進(jìn)化樹(shù)Fig.4 A phylogenetic tree of family proteins of CarKCS and KCS gene

2.4 CarKCS基因種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建

用AscI和BamHI分別雙酶切T－CarKCS和pFGC－5941.nap質(zhì)粒，切膠回收目的片段，并用T4連接酶將T－CarKCS片段和pFGC－5941.nap載體目的片段連接，根據(jù)pFGC－5941.nap載體序列和目的片段序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物用來(lái)檢測(cè)載體是否插入目的片段，引物序列如下:

NAP－F:5'－GCTTCTCTCTCACAGCACACA CATAC－3'

KCS－R:5'－ TGAACATGCAACAAGTCTTTAG CCAGATC－3'

從圖5中分析，2號(hào)和3號(hào)泳道均以pNapin－CarKCS質(zhì)粒為模板，2號(hào)泳道為檢測(cè)引物所擴(kuò)增出的條帶，大小為848 bp左右，與所設(shè)計(jì)的大小相符。3號(hào)泳道為KCS基因引物所擴(kuò)增出的條帶，大小為1.5 kb左右。說(shuō)明CarKCS片段已成功插入pFGC－5941.nap表達(dá)載體中，已成功構(gòu)建好pNapin－CarKCS過(guò)表達(dá)載體。

圖5 pNapin－CarKCS過(guò)表達(dá)載體的PCR檢測(cè)Fig.5 PCR detection of pNapin－CarKCS overexpression vector

2.5 種子特有表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

用AscI和 BamHI雙酶切所提的 pNapin－CarKCS質(zhì)粒，如圖6所示。泳道 2為 pNapin－CarKCS質(zhì)粒雙酶切后得到的片段長(zhǎng)度與目的片段的大小剛好相符，證明目的基因碎米薺β－酮脂酰－CoA合酶(KCS)基因已成功連接到 pFGC5941.nap質(zhì)粒為載體的植物表達(dá)載體中。進(jìn)一步驗(yàn)證了CarKCS片段已成功插入pFGC－5941.nap表達(dá)載體中，已成功構(gòu)建好 pNapin－CarKCS過(guò)表達(dá)載體。

圖6 pNapin－CarKCS過(guò)表達(dá)載體的酶切檢測(cè)Fig.6 Enzyme detection of overexpression vector of pNapin－CarKCS

3 討論

擬南芥是一種良好的十字花科模式植物。Rosska等以擬南芥為材料，分別對(duì)40粒開(kāi)花后3～15 d的未成熟種子和第17 d的成熟種子進(jìn)行了脂肪酸成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超長(zhǎng)鏈脂肪酸從第7 d才開(kāi)始出現(xiàn)，然后迅速積累直至第13 d，到第15 d種子接近成熟時(shí)超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成也隨之基本完成［19］。Tumham和Northocet通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中儲(chǔ)存脂也在胚發(fā)育中期合成速率最大［20］。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pNapin－CarKCS過(guò)表達(dá)載體啟動(dòng)子來(lái)源于甘藍(lán)型油菜種子儲(chǔ)藏蛋白Napin A基因的啟動(dòng)子，具有種子特異、高效表達(dá)的特性，能夠滿(mǎn)足超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶基因(KCS基因)在油菜種子中特異表達(dá)與調(diào)控。

圖7 CarKCS基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.7 Construction of the overexpression vector of CarKCS gene

芥酸是形成神經(jīng)酸的原料，通過(guò)KCS的延長(zhǎng)催化作用，加入2個(gè)碳原子后就能合成24:1的神經(jīng)酸。以往通過(guò)基因工程的方法獲得能產(chǎn)生神經(jīng)酸的轉(zhuǎn)基因植株，基本上是將克隆的KCS轉(zhuǎn)到擬南芥或其它植物中，如埃塞俄比亞芥。但這些植物往往不是大田作物，且芥酸(22:1)含量極低。油菜作為主要的油料作物之一，廣泛種植于中國(guó)、加拿大、澳大利亞及北歐國(guó)家，已成為第三大經(jīng)濟(jì)作物，菜子油已經(jīng)成為第三大植物油［21］;而且在油菜的一些材料中芥酸含量很高。所以，在成功構(gòu)建了碎米薺CarKCS基因的種子特異表達(dá)載體基礎(chǔ)之上，我們將進(jìn)一步通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化高芥酸含量的甘藍(lán)型油菜品種GX－29，以期獲得pNapin－CarKCS表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株，篩選出神經(jīng)酸含量高、產(chǎn)量高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因油菜植株，以為獲得廉價(jià)的神經(jīng)酸產(chǎn)品來(lái)滿(mǎn)足社會(huì)需求奠定基礎(chǔ)。

［1］馬柏林，梁淑芳，趙德文，等.含神經(jīng)酸植物的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004，24(12):2362－2365.

［2］王性炎，樊金栓，王姝清.中國(guó)含神經(jīng)酸植物開(kāi)發(fā)利用研究［J］.中國(guó)油脂，2006，31(3):69－71.

［3］候鏡德，陳至善.神經(jīng)酸與腦健康［M］.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

［4］Whitfield HV，Murphy DJ，Hills MJ.Sub－cellular localization of fatty acid elongase in developing seeds of Lunaria annua and Brassica napus［J］.Phytochemistry，1993，32:255－258.

［5］Ohlrogge JB，Browse JA.Lipid biosynthesis［J］.Plant Cell，1995，7:957 －970.

［6］Rossak M，Smith M，Kunst L.Expression of the FAE1 gene and FAE1 promoter activity in developing seeds oil.Arabidopsis thaliana ［J］.Plant Mol Biol，2001，46:717－725.

［7］Millar AA，Kunst L，The natural genetic variation of the fatty－acyl composition of seed oils in different ecotypes of Arabidopsis thaliana［J］.Phytochem，1999，52(6):1029－33.

［8］武玉花，盧長(zhǎng)明，吳 剛，等，植物芥酸合成代謝與遺傳調(diào)控研究進(jìn)展［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2005，27(2):82－86.

［9］GuoYM，Elzbieta Mietkiewska，Tammy Francis.Increase in nervonic acid content in transformed yeast and transgenic plants by introduction of a Lunaria annua L.3－ketoacyl－ CoA synthase(KCS)gene［J］.Plant Mol Biol，2009，69:565 –575.

［10］彭 琦，張 源，雙 桑，等.甘藍(lán)型油菜Fad2與Fae1基因雙干擾RNAi載體的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2007，(5):163 －166.

［11］王 灝，王道杰.用于RAPD分析的油菜總DNA的快速提?。跩］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，10(3):32－34.

［12］Han JX，Luhs W.Sonntag K，et al.Functional characterization of β － ketoacyl－ CoA synthase genes from Barssica napus L［J］.Plant Mol Biol，2001，46(2):229－239.

［13］Ghanevati M，Jaworski JG.Active－site residues of a plant membrane－bound fatty acid el ongase β－ketoacyl－ CoA synthase，F(xiàn)AE1 KCS［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1530(l):77－85.

［14］Ghanevati M，Jan G.Engineering and mechanistic studies of the Arabidopsis FAE1 β － ket oacyl－ CoA synthase，F(xiàn)AE1 KCS［J］.Eur J Biochem，2002，269:3531－3539.

［15］Beisson F，Koo AJ，Ruuska S，et al.Arabidopsis genes involved in acyl lipid metabolism［J］.Plant Physiol，2003，132:681 －97.

［16］Patricia Costaglioli，Jerome Joubes，Rene Lessire.Profiling candidate genes involved in wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana by microarray analysi［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2005，1734(3):247 －258.

［17］Trenkamp S，Martin W，Tietjen K.Specific and differential inhibition of very－long－chain fatty acid elongases from Arabidopsis thaliana by different herbicides［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(32):11903－11908.

［18］Paul S，Gable K，Beaudoin F，et al.Members of the Arabidopsis FAE1－like 3－ketoacyl－coA synthase gene family substitute for the elop proteins of Saccharomyces cerevisiae［J］.J Biol Chem，2006，281(14):9018 －9029.

［19］Rosska TJ，Lessire R，Puyaubert J，et a.l.Mutations in the fatty acid elongation 1 gene are associated with a loss of β － ketoacyl－ CoA synthase activity in low erucic acid rapeseed［J］.FEBS Letters，2001，492:107 －111.

［20］Tumham E，Nohrteote DH.Changes in the activity of acetyl－ CoA carboxylase during rape － seed formation［J］.Bioehem J，1983，212:223－229.

［21］潘 剛，周永明.甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2003，25(3):90－98.