張忠勝 梅元武 蘇慶杰 容瓊文

低分子量肝素（LMWH）是普通肝素經(jīng)化學(xué)或酶法解聚而得，目前主要用于血栓栓塞性疾病的防治［1，2］。已有臨床資料表明LMWH 可使缺血性腦血管疾病患者神經(jīng)功能缺損較好恢復(fù)，出血少，療效好，降低病死率和致殘率［3，4］。但低分子肝素是否對(duì)體外培養(yǎng)的缺血缺氧損傷神經(jīng)細(xì)胞有直接保護(hù)作用，目前相關(guān)的報(bào)道甚少。

本研究采用體外培養(yǎng)原代大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的方法，通過(guò)氧糖剝奪建立細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，觀察LMWH是否具有抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷的作用，并探討其可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用其治療缺血性腦血管病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生（出生24 h內(nèi)）雄性SD大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK（鄂）2010－0007）。

1.1.2 主要試劑 低分子肝素鈉（武漢祥云博生物公司，平均分子量5KD）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清購(gòu)自HyClone公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）購(gòu)自武漢博士得生物公司；0.25%胰蛋白酶、Neuronbasal培養(yǎng)液、B27添加劑購(gòu)自GIBCO公司；L－多聚賴氨酸、熒光染料Hoechst33258、阿糖胞苷（Ara－c）、HEPES購(gòu)自Sigma公司。An－nexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱：Napco 5410－220，（美國(guó)）；倒置相差顯微鏡：OLYMPUS公司（日本）；熒光顯微鏡：OLYMPUS公司；流式細(xì)胞儀：FACSCLSR，Becton－Dickton（美國(guó)）；Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀（日本）；

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定取新生SD大鼠，冰凍麻醉后用75%乙醇消毒，無(wú)菌條件下剪剝頭皮、顱骨，取腦，將腦組織置于冷無(wú)菌PBS液中，剔除腦膜、血管，分離出整個(gè)大腦，PBS液沖洗3次，用眼科剪剪成1 mm3的碎塊，加入0.25%胰酶，37℃溫箱內(nèi)消化20 min，完全培養(yǎng)液終止消化10 min，用滴管吹打混勻后在1000 r／min下離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液5 m1，過(guò)200目篩網(wǎng)，1000 r／min下離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用吸管輕輕吹打，超凈臺(tái)靜置10 min，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×106／ml的密度種植于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換維持培養(yǎng)液，第3 d開(kāi)始在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷作用48 h，然后更換培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次換半量；接種第7 d可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞突起連接成網(wǎng)，可用于后續(xù)試驗(yàn)；采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）免疫熒光染色鑒定神經(jīng)細(xì)胞。

1.2.2 大鼠神經(jīng)細(xì)胞體外模擬缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注組模型的建立參照Goldberg，Meloni［5，6］等的方法，并略作改動(dòng)；取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，清洗后加入無(wú)糖Earle＇s液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于缺氧罐內(nèi)，向罐內(nèi)持續(xù)緩慢通入含有95%N2和5%CO2的混合氣體以排除空氣；通氣30 min后夾閉缺氧罐的進(jìn)口與出口，置于培養(yǎng)箱內(nèi)密閉6 h（體外模擬缺血，ischemia，IS），取出缺氧罐，吸去無(wú)糖Earle＇s液，換回維持培養(yǎng)液，放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（再灌注，reperfusion，RE）24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 低分子肝素對(duì)缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞活力的作用

培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞至7 d，分組：（1）對(duì)照組；（2）IS／RE組；（3）IS／RE＋LMWH 組（按濃度不同又分為4個(gè)組，LMWH在造IS／RE模型前2 h加入）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：取原代神經(jīng)細(xì)胞（細(xì)胞計(jì)數(shù)1×106／ml），按每孔100μl接種于96孔板，設(shè)置空白對(duì)照組（用來(lái)調(diào)零，只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（藥物濃度為零，加細(xì)胞，加培養(yǎng)基）、藥物組（加藥物，加細(xì)胞，加培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT 15 ul，37℃孵育4 h，鏡下觀察形成紫色針狀結(jié)晶，棄去上清，每孔加入DMSO100 ul，室溫下放置10 min；待鏡下觀察紫色結(jié)晶全部溶解后，以Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀測(cè)定MTT吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值）×100%；篩選合適LMWH濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Annex in V－FITC／PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化

常規(guī)方法操作。分組：（1）對(duì)照組；（2）IS／RE組；（3）IS／RE＋LMWH組。后續(xù)試驗(yàn)均按此分組。操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］測(cè)定 采用雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)法，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5.1 制備細(xì)胞懸液 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至7 d；用0.25%的胰蛋白酶37℃消化10分鐘，再用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1000 r／min離心5 min，以Hank液洗滌一遍，用含0.4%牛血清白蛋白的臺(tái)氏液（Tyrode）制成懸液，要求細(xì)胞密度為1x106／ml；用0.4%臺(tái)盼藍(lán)（Trypan Blue）溶液做排斥實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞存活率，要求存活率達(dá)到90%以上。

1.2.5.2 負(fù)載Fura－2／AM 向37℃預(yù)溫的細(xì)胞懸液中加入10ulCa2＋熒光指示劑Fura－2／AM（終濃度4μM），于37℃避光孵育負(fù)載45 min。負(fù)載后以臺(tái)氏液清洗，1000 r／min離心5 min，用含0.4%牛血清白蛋白的臺(tái)氏液（Tyrode）重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1x106／ml。

1.2.5.3 測(cè)定熒光強(qiáng)度 激發(fā)波長(zhǎng)340 nm、380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm，37℃恒溫下測(cè)定。Fura－2／AM 檢測(cè)的［Ca2＋］i計(jì)算公式為：［Ca2＋］i＝Kd［（RRmin）／（Rmax－R）］（Fmin／Fmax）。其中，Kd為 Fura－2與Ca2＋反應(yīng)的解離常數(shù)，為224 n M；R為各測(cè)定點(diǎn)F340／F380熒光強(qiáng)度比值；Rmax、Rmin分別為測(cè)定的最大和最小熒光比值：加破膜劑Triton X－100（終濃度為0.1%），使Fura－2和Ca2＋結(jié)合達(dá)飽和時(shí)，測(cè)得的F340／F380為Rmax；加入高濃度的 Ca2＋螯合劑EGTA（終濃度為5 m M，p H 8.5），以充分螯合 Ca2＋，使Fura－2游離，測(cè)得的F340／F380為Rmin；Fmin、Fmax分別代表Ca2＋為零及飽和時(shí)，在380 nm激發(fā)光下測(cè)得的Fura－2熒光強(qiáng)度（F380）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 原代大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

原代SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)至第7天，可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，胞體飽滿，胞核明顯，突起延長(zhǎng)，相互間連接成網(wǎng)絡(luò) （圖1）。細(xì)胞免疫熒光染色顯示胞漿及突起顯亮綠色熒光，呈NSE陽(yáng)性，證明神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)成功（圖2）。

圖1 培養(yǎng)至7 d的神經(jīng)細(xì)胞的突起明顯，相互間連接成網(wǎng)絡(luò)（×200倍）

圖2 神經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定 NSE染色呈綠色熒光（×200倍）

2.2 低分子肝素對(duì)缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞活力的作用

MTT法檢測(cè)顯示，對(duì)照組細(xì)胞在未加任何干預(yù)的情況下其在570 nm處的光密度值（OD值）為0.851；缺血再灌注組（IS／RE）的 OD值明顯降低，為0.648，與對(duì)照組比較有明顯差異，IS／RE＋LMWH各組均可見(jiàn)OD值有升高，但只有濃度為0.5、2.5、5.0三個(gè)組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中LMWH濃度5.0μg／m組OD值升高最明顯，達(dá)到0.760，但仍低于對(duì)照組（表1）。

表1 各組的光密度值及細(xì)胞存活率（x±s）

表1 各組的光密度值及細(xì)胞存活率（x±s）

注：與對(duì)照組比較，ΔP＜0.01；與IS／RE組比較，＃P＞0.05；與IS／RE組比較，φP＜0.01

組別 LMWH濃度（μg／ml）光密度值（OD值）細(xì)胞存活率（%）31 034 100缺血組 — 0.648±0.030Δ 76.15低分子肝素組 0.1 0.653±0.029＃ 76.73 0.5 0.718±0.013φ 84.37 2.5 0.737±0.005φ 86.60 5.0 0.760±0.003φ 89.對(duì)照組 — 0.851±0.

2.3 Annexin V－FITC和PI聯(lián)合染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率較低，為4.6%；體外模擬缺血6 h再灌注24 h后細(xì)胞凋亡率明顯增加，為19.6%，兩組比較差異明顯（P＜0.01）；低分子肝素組在缺血前2 h加入LMWH后細(xì)胞凋亡率與缺血組比較有明顯下降，為10.51%，差異明顯（P＜0.01）（圖3、4）。

圖3 各組細(xì)胞的凋亡率

圖4 各組的流式凋亡率柱狀圖比較 1為對(duì)照組，2為缺血再灌注組，3為缺血再灌注＋低分子肝素組

2.4 低分子肝素對(duì)缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞胞漿鈣離子濃度的調(diào)節(jié)作用

雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)法測(cè)定各組鈣離子濃度，對(duì)照組胞漿［Ca2＋］i為（83.81±2.99）nmol／L；缺血再灌注處理后神經(jīng)細(xì)胞胞漿［Ca2＋］i為（142.13±4.23）nmol／L，明顯高于對(duì)照組，差異明顯；低分子肝素預(yù)處理后的缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞其［Ca2＋］i為（112.61±4.06）nmol／L，明顯低于缺血再灌注組（P＜0.01）（表2）。

表2 各組細(xì)胞的［Ca2＋］i比較（±S）

表2 各組細(xì)胞的［Ca2＋］i比較（±S）

注：與對(duì)照組比較，ΔP＜0.01；與IS／RE比較，φP＜0.01

組別 ［Ca2＋ ］i：99 IS／RE組 142.13±4.23Δ IS／RE＋LMWH組 112.61±4.06Δφ對(duì)照組 83.81±2.

3 討 論

Ca2＋是細(xì)胞重要的第二信使之一，有著廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)功能，能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元的興奮性。維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)具有重要意義，目前已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體是細(xì)胞內(nèi)兩種主要的鈣庫(kù)，當(dāng)前研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)主要是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)保持的［7］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有3種與鈣離子的攝入和釋放相關(guān)的通道：向胞漿釋放鈣離子的藍(lán)尼啶受體通道（ryanodine receptor，Ry R）和1，4，5－三磷酸肌醇受體通道（inositol，1，4，5－triphosphate receptor，IP3R）以及將鈣離子由胞漿泵至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣泵通道（Ca2＋ATPase）（Sarcoplasmic／endoplasmic reticulum Ca2＋ATPase，SERCA）。在正常的情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通Ry R和IP3R將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的鈣離子釋放入胞質(zhì)，通過(guò)鈣泵從胞漿中攝取鈣離子入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞質(zhì)中的鈣離子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。缺血再灌注時(shí)鈣離子的這種平衡穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度增高，從而引起細(xì)胞損傷［8］。本研究顯示對(duì)照組［Ca2＋］i為83.81 nmol／L，缺血再灌注組為142.13 nmol／L，明顯高于正常組，從而也證明了這一點(diǎn)。

目前已明確肝素不僅可作為抗凝劑用于防治血栓性疾病，而且還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R受體的特異性拮抗劑，可以拮抗IP3所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的鈣釋放［9］。然而由于普通肝素分子量大，難以透過(guò)細(xì)胞膜，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)須采用特殊方法注射入細(xì)胞內(nèi)才能起作用，而且因出血等副作用較多也限制了其臨床應(yīng)用。而分子量較小的LMWH則可以通過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用。但是LMWH是否也能拮抗IP3IP3所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的鈣釋放，目前尚無(wú)肯定報(bào)道。

本研究采用不同濃度的低分子肝素作用于缺血缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞，結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)（0.1～5.0μg／ml），LMWH 均能提高細(xì)胞的存活率，在0.1μg／ml時(shí)細(xì)胞活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但0.5 μg／ml、2.5μg／ml、5.0μg／ml三個(gè)濃度作用后細(xì)胞活力均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且該效應(yīng)呈劑量依賴性。進(jìn)一步測(cè)各組細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組為4.6%，缺血再灌注模型組為19.6%，而經(jīng)5.0μg／ml LMWH預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯下降，為10.51%，顯示LMWH具有明顯的抗缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。通過(guò)測(cè)定各組細(xì)胞的胞質(zhì) ［Ca2＋］i，發(fā)現(xiàn) LMWH 預(yù)處理組的胞質(zhì)［Ca2＋］i為112.6 1nmol／L，明顯低于缺血再灌注組的142.13 nmol／L。由此本研究推測(cè)，低分子肝素的這種神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)拮抗神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IP3R，抑制缺血再灌注時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2＋經(jīng)IP3R釋放，從而減輕鈣超載，降低胞質(zhì)鈣離子濃度產(chǎn)生的。這也可能是低分子肝素治療血栓性疾病有效的另一機(jī)制。

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