陳剛 梁奕敏 李青峰

瘢痕疙瘩是一種持續(xù)生長(zhǎng)并超出原皮膚創(chuàng)緣的病理性瘢痕，以成纖維細(xì)胞的不斷增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（特別是膠原）的過度沉積為特征，被視為人類獨(dú)有的真皮成纖維細(xì)胞腫瘤[1-3]，現(xiàn)有的治療方法效果欠佳，復(fù)發(fā)率極高[4-5]。

近來的研究認(rèn)為，丹參與黃芪的混合提取物（CASE）可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路，抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲及膠原合成[6]。但CASE具體成分不明，而丹參酮IIA是丹參的主要活性成分之一，具有誘導(dǎo)白血病THP-1細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用[7－13]。本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用丹參酮ⅡA干預(yù)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，觀察其對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，以期為臨床治療瘢痕疙瘩提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

丹參酮ⅡA（上海第一生化藥業(yè)有限公司）、胎牛血清FBS（美國(guó)BD公司），DMEM高糖培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）、Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司）、CCK-8（日本Dojindo公司）、胰蛋白酶(美國(guó)Difco公司)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 （美國(guó)Thermo公司）、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （美國(guó)BD公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用瘢痕疙瘩材料均來源于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科 （術(shù)前經(jīng)患者同意），術(shù)后病理證實(shí)與臨床診斷一致。材料來源患者均無長(zhǎng)時(shí)間外用瘢痕藥物史，不伴有腫瘤及其他嚴(yán)重疾病。取材后以胰酶消化法培養(yǎng)癱痕疙瘩成纖維細(xì)胞[14]，第1~2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)采用兩因素析因設(shè)計(jì)分組，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞以含有不同濃度丹參酮ⅡA的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)濃度分別為（0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和200 μg/mL），不同干預(yù)時(shí)間觀察細(xì)胞增殖、凋亡及周期變化，以 0 μg/mL 組為對(duì)照組，50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL為實(shí)驗(yàn)組。各組至少重復(fù)3次。

1.4 CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖情況

取細(xì)胞濃度1.5×104cells/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL， 按分組進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)，培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h和120 h。按照CCK-8試劑盒操作說明，更換普通培養(yǎng)液后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，吸光值間接反映活細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)公式求出增殖抑制率（IR）。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

上述濃度細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種1 mL，分別培養(yǎng)24 h、72 h和120 h后，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)專用試劑盒的操作說明書操作，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入Annexin V-FITC 試劑 5 μL，1× Annexin V Blanding Buffer 60 μL孵育10 min后， 加入 PI試劑 5 μL及1× Annexin V Blanding Buffer 120 μL，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析Annexin V陽(yáng)性且PI陰性細(xì)胞所占百分比，即細(xì)胞早期凋亡率。根據(jù)公式求出早期凋亡增加百分比。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

上述濃度細(xì)胞懸液接種于90 mm培養(yǎng)皿，每皿接種3 mL，培養(yǎng)24 h、72 h和120 h后收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃保存過夜，PBS洗滌，加入20 μL RNase，37℃孵育30 min后，暗處加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目篩網(wǎng)過濾。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109cells/mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，記錄每例細(xì)胞樣品的G0/G1期、G2/M期、S期細(xì)胞百分比。根據(jù)公式計(jì)算G0/G1期細(xì)胞增加百分比。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的影響

各實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖活性受到不同程度抑制，其中200 μg/mL組干預(yù)72 h、96 h和120 h后抑制作用十分明顯，其增殖抑制率（IR）分別為100%、76.29%和71.72%。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，干預(yù)濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)細(xì)胞活性的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。采用LSD方法兩兩比較，不同干預(yù)時(shí)間的細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），不同干預(yù)濃度的細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖1）。

2.2 丹參酮ⅡA誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的情況

各實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的早期凋亡率明顯增高，其中200 μg/mL組早期凋亡率增高最為明顯，干預(yù)120 h后，早期凋亡率達(dá)41.62%，早期凋亡增加百分比達(dá)1 030.98%。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，干預(yù)濃度對(duì)早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)時(shí)間對(duì)早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)早期凋亡率的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。采用LSD方法兩兩比較，不同干預(yù)時(shí)間的早期凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。不同干預(yù)濃度的早期凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖2、3）。

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞周期的影響

圖1 CCK-8測(cè)定各組細(xì)胞增殖情況Fig.1 The cell proliferation of each group by CCK-8 examine

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)120小時(shí)后各組細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Schematic diagram of the cell apoptosis 120 hours after arresting by flow cytometry examine

各實(shí)驗(yàn)組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的G0/G1期比例均不同程度增加，其中200 μg/mL組G0/G1期比例增加最為明顯，干預(yù)120 h后，G0/G1期均值為94.16%，增加38.82%。干預(yù)濃度對(duì)G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)時(shí)間對(duì)G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的交互作用對(duì)G0/G1期比例的影響也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。采用LSD方法兩兩比較，干預(yù)時(shí)間24 h與72 h、120 h的G0/G1期比例差異均有顯著差異（P<0.001）；干預(yù)72 h和120 h比較，G0/G1期比例無顯著差異（P=0.07）；200 μg/mL 組與 0 μg/mL組、50 μg/mL 組、100 μg/mL 組的 G0/G1 期比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.001），0 μg/mL 組與 50 μg/mL組、100 μg/mL組的G0/G1期比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.001），50 μg/mL 組與 100 μg/mL 組的G0/G1期比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.937）（圖 4、5）。

圖3 流式細(xì)胞儀測(cè)得各組細(xì)胞早期凋亡情況Fig.3 The cell early apoptosis of each group by flow cytometry examine

圖4 干預(yù)120 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況Fig.4 Schematic diagram the cell cycle 120 hours after arresting at each group by flow cytometry examine

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期G0/G1期比例情況Fig.5 The cell cycle G0/G1 phase ratio of each group by flow cytometry examing

3 討論

瘢痕疙瘩是常見疾病，也是臨床的治療難點(diǎn)，其難治性和高復(fù)發(fā)率與瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞相比，其Ⅰ型膠原及纖維粘連蛋白過度表達(dá)且膠原多肽的降解降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積；VEGF、TGF-β1、TGF-β2等生長(zhǎng)因子及PDGF-α受體等生長(zhǎng)因子受體過度表達(dá)，同時(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的刺激反應(yīng)敏感；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增生及凋亡失衡，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡率要明顯低于正常成纖維細(xì)胞[15-19]。常用的瘢痕疙瘩治療方法中，5-氟尿嘧啶注射的治療原理為誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期[20]，類固醇注射和放射治療的原理之一也是增加瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡率[15]。因此，尋找瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡缺陷機(jī)制，并有效誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)瘢痕疙瘩的治療具有重要意義[21-23]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組早期凋亡率明顯升高，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高。經(jīng)兩個(gè)因素析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，不同濃度丹參酮ⅡA干預(yù)和不同時(shí)間干預(yù)，對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高濃度的200 μg/mL組干預(yù)效果最明顯，提示丹參酮ⅡA對(duì)抑制體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期等方面，均呈現(xiàn)干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)間的依耐性。CCK-8檢測(cè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL組干預(yù)72 h后，細(xì)胞增殖抑制率最高（100%）；隨后干預(yù)至96 h和120 h后，細(xì)胞增殖抑制率降低，分別為76.29%和71.72%，考慮增殖抑制率的這種下降趨勢(shì)是由于干預(yù)至96 h和120 h后，出現(xiàn)接觸抑制所致。

曾有研究將丹參酮ⅡA應(yīng)用于兔耳增生性瘢痕模型中，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對(duì)兔耳增生性瘢痕有明顯的抑制作用[24]。另?yè)?jù)報(bào)道，丹參酮ⅡA具有抑制膽管來源成纖維細(xì)胞增殖及膠原的分泌，并誘導(dǎo)MMP-9 mRNA的表達(dá)而促進(jìn)膠原降解，抑制膽道瘢痕形成的作用[25]。由此可見，丹參酮ⅡA對(duì)瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均有一定的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，凋亡抑制基因Bcl-2異常高表達(dá)[26]，凋亡誘導(dǎo)基因P53表達(dá)異常[27]，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）過度表達(dá)并且磷酸化[28]，而丹參酮ⅡA已被證實(shí)可通過下調(diào)Bcl-2，激活P53，抑制STAT3，激活Caspase-3等多種途徑，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[13，29-31]。因此，考慮丹參酮ⅡA可能也是通過下調(diào) Bcl-2，激活 P53，抑制 STAT3，激活 Caspase-3等途徑對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞產(chǎn)生干預(yù)作用，其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究探討。

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