李佳濱 張文杰 崔福齋 杜曉巖

骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種存在于骨髓內(nèi)的成體干細胞，因具有多向分化潛能和高增殖活性，目前已成為骨組織工程中理想的種子細胞。BMSCs可在成骨誘導培養(yǎng)條件下向成骨細胞分化[1]。研究證實，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）是目前成骨誘導活性最強的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一，屬于TGF-β超家族成員[2]。因純化天然BMP2程序復雜，不易獲得，所以基因重組的BMP2研發(fā)是目前研究的熱點。本實驗根據(jù)BMP-2的核心功能區(qū)氨基酸序列，合成一條含有17個核苷酸的P17-BMP2，旨在觀察P17-BMP2聯(lián)合成骨誘導劑促使BMSCs向成骨細胞分化的能力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

P17-BMP2多肽（清華大學合成提供）；DMEMLG培養(yǎng)基、DMEM-HG培養(yǎng)基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素、特級胎牛血清(Gibco公司，美國)；β-甘油磷酸二鈉（Sigma 公司，美國）；地塞米松（Sigma公司，美國）；抗壞血酸（Sigma公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所）；熒光顯微鏡（Olympus IX70，日本）；核酸蛋白分析儀（DU-800，美國）；熒光定量PCR儀（MX3000P，美國）；高速冰凍離心機（Beckman 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離培養(yǎng)及分組

取4周齡Wistar雄性大鼠9只（上海第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供），脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒5min，無菌條件下取出雙側脛骨和股骨，剪除骨端，止血鉗壓碎，5 mL的DMEM完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，100 mg/mL青、鏈霉素）沖洗骨髓腔，使骨髓細胞充分分散，將收集的骨髓用吸管打勻，加入離心管，1500 r/min離心5min，棄上清，用適量DMEM打勻制成單細胞懸液，取懸液1 mL（1只大鼠一培養(yǎng)皿）至 25 cm培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5%CO2孵育箱中，48 h后換液，以后每 3天換液1次。待細胞匯合成80%～90%單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，取第3代的細胞備用。

分4組培養(yǎng)：對照組（A組）、成骨誘導組（B組）、成骨誘導+P17-BMP2組（C組）、單純P17-BMP2組（D組）。A組：采用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組：含地塞米松10-7mol/L、Vit C 10 mg/L及β-甘油磷酸鈉（β-sodium glycerophosphate，β-GP）10 mmol/L 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；C組：成骨誘導液+P17-BMP2（10 μg/mL）培養(yǎng)；D 組：含 P17-BMP2（10 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖測定

取第3代對數(shù)生長期的BMSCs離心稀釋吹打成濃度為1×104cells/mL的均勻單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞懸液量為100μL，設3個復孔，同時設立空白對照孔（加培養(yǎng)基100μL），孔板周圍加PBS 100μL保持濕度。共接種4個96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，以后3 d換液一次，于培養(yǎng)第1、3、5、7天取出，每孔加入CCK-8試劑10μL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各組的吸光光度值，取3個孔OD平均值，檢測波長為450 nm。采集3只大鼠的骨髓重復3次。

1.2.3 堿性磷酸酶染色

取第3代細胞，接種于24孔培養(yǎng)板，各組培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。PBS洗滌3次，放置4℃固定液，流水沖洗，晾干；將二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入緩沖液中；再加入固紫B混勻；將工作液置于37℃水溫箱45min，流水沖洗；顯微鏡觀察。采集3只大鼠的骨髓重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)NCBI Genebank序列行引物設計，引物由上海英濰捷基有限公司合成并經(jīng)質量檢測，開蓋前短暫離心，加入經(jīng)DEPC處理的ddH2O稀釋至濃度為 10 nmol/μL，-20℃儲存?zhèn)溆谩PN引物序列：Forward primer 5-CATCAGAGCCACGAGTTTCA-3；Reverse primer 5-TCAGGGCCCAAAACACTATC-3；OCN引物序列：Forward primer 5-TGCCTTCTGTCTGGGTGTCC-3；Reverse primer 5-GCTGTGCCGTCCATACTTTCG-3；Runx2引物序列 ：Forward primer 5-CAACATCTCCACATCATTAG-3；Reverse primer 5-TTATTACCCTCTCAAACACTG-3；β-Actin引物序列：Forward primer 5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTA -3；Reverse primer 5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。

培養(yǎng)7 d、14 d后分別收集細胞，使用Trizol一步法抽提細胞總RNA。每組各3個復孔，Q-PCR重復檢測。采集3只大鼠的骨髓重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Origin 8.0統(tǒng)計軟件分析，將以上數(shù)據(jù)進行t檢驗，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs形態(tài)學特征

熒光顯微鏡下觀察，細胞接種24h即可貼壁，48 h后細胞貼壁呈成纖維細胞樣外觀，3～7 d細胞處于對數(shù)生長期，增殖明顯，呈單層生長。C組用含P17-BMP2的成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d后，細胞形態(tài)由梭形轉變?yōu)闄E圓或多角形，出現(xiàn)無規(guī)則堆積，融合生長時細胞變短，形態(tài)扁平，核及核仁清晰可見（圖 1）。

圖1 各組BMSCs體外誘導7 d后的組織學觀察（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1 The histological observation of BMSCs in each group 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.2 細胞增殖測定

細胞培養(yǎng)第 1、3、5、7天時，通過 CCK-8對大鼠BMSCs增殖進行檢測，發(fā)現(xiàn)與A組相比，D組對大鼠BMSCs增殖無影響，而B組對BMSCs細胞增殖起促進作用，C組細胞增殖能力顯著提高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。在增殖第7天時，成骨誘導組對細胞增殖作用不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）（圖 2）。

2.3 堿性磷酸酶染色

體外誘導7 d，各組堿性磷酸酶染色均為陽性，但染色強度有差異，C組>B組>D組>A組。顯微鏡下觀察可見陽性區(qū)域胞質內(nèi)有紫色顆粒（圖3）。

圖2 各組細胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve of each group

圖3 各組BMSCs體外誘導7 d后AKP染色大體觀及鏡下觀察（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.3 The gross and histological observation of BMSCs by AKP staining 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖4 各組BMSCs體外培養(yǎng)第7、14天成骨特異性基因OPN、OCN、Runx2的表達Fig.4 The expression of OPN,OCN and Runx2 of each group at the 7th and 14th day after induction

2.4 Q-PCR檢測OCN、OPN、Runx2的mRNA表達

Q-PCR結果顯示，在誘導第7天，B、C、D組均表達成骨特異性基因，與對照組相比，B組和C組中所有檢測基因的表達均顯著提高（P<0.05），而D組與對照組相比無顯著差異。在誘導第14天時，B組和C組中所有檢測基因與對照組相比有顯著差異（P<0.05）；D組與對照組相比，OCN和OPN的表達有顯著差異（P<0.05）（圖4）。

3 討論

BMP2屬于TGF-β超家族中的一員，因其誘導成骨活性最強，可促進骨形成并分泌特異性成骨細胞產(chǎn)物，如 COL、OPN、OCN 等。研究表明，BMP-2的信號傳導通過Smads途徑或MAPK途徑，激活轉錄因子Runx2和Osx，從而啟動成骨細胞特異性的基因表達[3-4]。以往研究表明，在成骨過程中，BMSCs在局部BMP2的刺激下發(fā)生化學趨向、聚集、分化形成軟骨和骨[5-6]。天然人BMP2成熟肽由114個氨基酸組成，但真正發(fā)揮骨誘導作用的只是由20余個氨基酸組成的核心結構。隨著分子生物學技術的發(fā)展，基因重組技術的成功應用，解決了BMPs生產(chǎn)成本高和產(chǎn)量低的問題。近10年來，人們利用分子基因工程和生物學等技術開展了基因重組BMP2的工作，但目前重組BMP2臨床使用費用高，提取方法繁雜，而且存在潛在的致癌風險，難以滿足臨床和研究的需求。本實驗中P17-BMP2的核心功能區(qū)是由17個氨基酸組成的寡肽BMP2，其活性點易于暴露，合成方法簡單，可以通過特定的細胞通訊與信息傳遞對細胞的成骨定向分化起調控作用，具有一定骨誘導性。與rhBMP-2相比較，短鏈多肽相對于蛋白質有很多優(yōu)點：①小分子的多肽可以用多肽合成儀快速大規(guī)模地制備，克服基因工程技術合成大分子蛋白質時工藝復雜、價格昂貴的弊端；②小分子多肽結構簡單，其活性位點暴露充分，并易與細胞的受體充分結合，易于合成，能生產(chǎn)出不同劑型的多肽，且生物學活性和穩(wěn)定性較好。前期實驗證實了P17-BMP2具有促進骨髓間充質干細胞成骨分化的作用，并篩選出P17-BMP210 μg/mL的劑量對大鼠BMSCs的成骨分化作用最為明顯。大多數(shù)誘導實驗中使用的 BMP2 為 20～200 μg/mL[7-9]，段智霞等[10]研究顯示P24-BMP2活性多肽在體外能誘導BMSCs向成骨方向分化，最佳劑量為200 μg/mL，低于此劑量誘導效果不明顯，高于此劑量誘導效果無明顯增強，而副作用增加明顯。本實驗結果與以往實驗相似。

BMSCs成骨誘導的方法很多，既往的研究已證明，BMSCs在礦化培養(yǎng)基（地塞米松、甘油磷酸鈉和L-抗壞血酸）培養(yǎng)下可向成骨細胞分化。含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉和L-抗壞血酸的礦化培養(yǎng)基（OS培養(yǎng)基）[11]被認為是經(jīng)典的成骨誘導培養(yǎng)基。Rickard等[12]研究表明，BMP和DEX的聯(lián)合作用比單純使用BMP的骨誘導性高，認為BMP可能并不單獨發(fā)生作用，在整個骨誘導過程中可能需要激素的協(xié)同作用?；谝陨辖Y果，本實驗中將P17-BMP2與成骨誘導劑聯(lián)合應用，發(fā)現(xiàn)成骨誘導組和單純P17-BMP2組在第7天、第14天表達成骨特異性基因OCN、OPN及Runx2，當P17-BMP2與成骨誘導劑聯(lián)合應用時成骨特異性基因OCN、OPN及Runx2的表達與其他各組都有顯著性差異。這說明在成骨分化中P17-BMP2與成骨誘導劑聯(lián)合應用比單純應用P17-BMP2因子的骨誘導性高，并可上調特異性成骨細胞產(chǎn)物OCN、OPN及Runx2的mRNA表達，體外誘導7 d后堿性磷酸酶染色結果同樣證實了這一點。為了能更好證明P17-BMP2多肽的骨誘導活性和成骨作用，我們下一步實驗將以P17-BMP2復合在生物支架材料上，觀察其在體內(nèi)的異位成骨能力。

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