常毅 鄧辰亮 屈悅 鄭江紅 萬偉東 楊松林

皮膚衰老與膠原蛋白、透明質(zhì)酸的含量明顯減少緊密相關(guān)。膠原作為一種結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動物的皮膚、肌腱和其他結(jié)締組織中。富含膠原蛋白的組織很容易表現(xiàn)出一些與年齡相關(guān)的生理變化。因此，膠原蛋白一直被當作探討衰老機制的重要指標而備受重視[1，2]。 透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA），是一種大分子酸性粘多糖，廣泛存在于生物體的結(jié)締組織中，皮膚中HA含量豐富。皮膚中HA含量的減少及破壞，可造成皮膚失水[3]，彈性纖維和膠原纖維發(fā)生斷裂老化[4]，降低皮膚吸收性，使人表皮衰老，如果把20歲的人體內(nèi)HA相對含量定為100%，則30歲、50歲和60歲時分別下降為65%、45%和25%。當皮膚衰老時，皮膚膠原蛋白與HA的含量會明顯減少。

富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是全血經(jīng)過分離而得到的血小板濃縮物。眾所周知，血小板在愈合過程中具有抗炎、促血管再生及組織修復(fù)的功能[5]。研究顯示，PRP中血小板計數(shù)是普通全血中的4.38倍[6]。臨床證據(jù)顯示，PRP對硬組織及軟組織明顯有效的治療作用是由于生長因子（GFs）儲存于血小板中。當生長因子從血小板中釋放出來，可以引發(fā)組織再生程序[7-8]。另外，PRP中含有其他內(nèi)在和外在的血小板成分也能促進組織再生[9]。PRP中最主要的成分是血小板、白細胞和纖維蛋白。此外，血小板激活的過程中，通過脫顆粒作用釋放大量的生長因子，如血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)移生長因子－β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）等[10]，還有纖維連接蛋白 （FN）、血小板反應(yīng)蛋白（Thrombospondin，TSP）、 骨連接蛋白（Osteonectin，ON）、玻璃體連接蛋白（Vitronectin，VN）等。

由于PRP來源于自體，制作簡單，且安全有效，已廣泛運用于整形外科、骨科、血管外科、口腔科、頜面外科和胸外科等[11-16]。同時，各種關(guān)于PRP的基礎(chǔ)研究也都展開，其中細胞實驗包括了PRP對成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞和上皮細胞、神經(jīng)細胞的研究；動物實驗涉及到PRP促進大鼠腸吻合和心肌損傷的修復(fù)、促進犬牙周組織的修復(fù)、促進大鼠神經(jīng)組織的修復(fù)、對角膜穿孔及兔板層角膜移植術(shù)的輔助治療等[17-25]。其中，PRP對齒齦成纖維細胞的促進增殖作用及對牙周組織的修復(fù)作用引起了我們的關(guān)注。本實驗旨在探討PRP能否通過促進人皮膚成纖維細胞增殖，及其有效成分的合成釋放，以緩解皮膚老化的程度。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

胎牛血清（上海洛神生物科技有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；透明質(zhì)酸酶（Sigma公司，美國）；96孔培養(yǎng)板、T75細胞培養(yǎng)瓶（Corning 公司，美國）；0.22 μm 一次性濾器（Millipore公司，瑞士）；Trizol試劑（Invitrogen 公司，美國）；焦碳酸二乙酯（Amersco公司，美國）；PCR引物（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、DNA Marker、6× loading buffer（大連寶生物工程有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司，西班牙）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；恒溫水浴箱（上海精宏實驗儀器廠）；離心機 （上海安亭實驗儀器廠）；XK 96-3型微量振蕩器 （姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；高壓鍋 （Sanyo公司，日本）；Milli-Q純水機（Millipore公司，美國）；蝸旋器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；高速低溫離心機、普通PCR儀、紫外/可見分光光度計（Eppendorf公司，德國）；水平電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng) （Syngene公司，美國）；全波長酶標儀（Bio-tek公司，美國）；流式細胞儀（Beckman 公司，美國）。

1.2 PRP的制備及稀釋

用預(yù)先裝有3.0 mL ACD-A抗凝劑的50 mL針筒，以18 G針頭取患者全血（獲知情同意）30 mL，平均注入6支塑料離心管，以Aghallo法進行離心。分2次離心，第一次215 g離心10 min，吸取全部上清液至交界面下約3 mm，移至另一離心管，平衡后再次離心，第二次863 g離心10 min，離心管中液體分為兩層，上層上清液為貧血小板血漿 （Plateletpoor plasma），下層為血小板濃縮物（Platelet concentrate，PC）。吸取約3/4上清液棄掉，剩余約0.7 mL搖勻，即PRP。

1.3 膠原蛋白酶消化培養(yǎng)

標本取自健康患者上瞼或下瞼手術(shù)時切除的皮膚，患者年齡20~56歲，獲患者知情同意。將獲取的皮膚置于含有青霉素（100 KU/L）和鏈霉素（100 mg/L）的PBS中反復(fù)漂洗后，去除皮下脂肪。將皮條剪成2 mm×6 mm的小條，以0.25%DispaseⅡ4℃消化8~11 h，用尖鑷將表皮揭下，將分離的真皮用組織剪充分剪碎，置于0.1%Ⅰ型膠原酶中，37℃消化3.5 h，用吸管輕輕反復(fù)吹打，至上清渾濁，通過100目無菌不銹鋼紗網(wǎng)過濾，離心10 min（1 000 r/min），臺盼藍染色，計數(shù)未著色細胞，以6×104cells/cm2的密度分別接種于T75培養(yǎng)瓶中，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中以15 mL的DMEM/F12進行培養(yǎng)，培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液，以后每周更換2~3次。

1.4 MTT法檢測PRP對細胞增殖能力的影響

通過標準曲線確定每孔細胞數(shù)為1×104個。原代細胞胰酶消化，用DMEM/F12培養(yǎng)液配成單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，接種3組，每組8個復(fù)孔，分別標記為1%、5%、10%、20%、30%、50%、-、+。第 2天，棄上清液，加入培養(yǎng)液及 PRP，用含不同濃度 PRP（1%、5%、10%、20%、30%、50%）的培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液為陰性對照，含10%新生小牛血清的培養(yǎng)液為陽性對照。第1組在加樣培養(yǎng)3 d后，取出培養(yǎng)板進行檢測。 每孔加入 MTT 溶液（5 g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值（A值）。進行統(tǒng)計學(xué)分析。第2組和第3組分別在加樣后第5天、第7天進行同樣操作。

1.5 RT-PCR檢測膠原蛋白表達

原代細胞胰酶消化，用DMEM/F12培養(yǎng)液配成單細胞懸液，以每孔2×106個細胞接種于6孔培養(yǎng)板的3個孔中，分別標記為50%、-、+。第2天棄液，往“50%”孔中加入1 mL DMEM/F12和1 mL PRP；往“-”孔中加入 2 mL DMEM/F12；往“+”加入 2 mL 10%新生小牛血清，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天按相同方法換液。第5天根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA。以MQ水作為空白對照，分別記錄RNA濃度及A260 nm/A280 nm。使用反轉(zhuǎn)錄酶分離RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。目的基因在Pubmed中得到序列號，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計COL1、COL3以及內(nèi)參GAPDH的引物。然后使用Taq酶試劑盒及引物進行PCR反應(yīng)。

1.6 ELISA分析測量HA

HA的分析測量使用特殊的酶聯(lián)蛋白試劑盒。100 μL的樣本加入96孔板，包括陰性對照組和陽性對照組，稀釋緩沖液為空白對照組。除空白對照組外均加入50 μL的檢測緩沖液。輕柔混勻，蓋板，37℃恒溫孵育30 min。孵育之后棄液，用緩沖液沖洗4次，每孔加入100 μL的有效酶?；靹蚝?，加蓋，37℃孵育30 min。然后，用沖洗緩沖液將檢測板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。暗室恒溫孵育后，加入50 μL的反應(yīng)終止溶液終止反應(yīng)。15 min內(nèi)，在405 nm波長下觀察吸光率，測出HA的濃度。

1.7 統(tǒng)計分析

SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測PRP對細胞增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示，隨細胞培養(yǎng)時間延長，細胞增殖數(shù)量增加；伴隨PRP濃度的增加，細胞增殖有增強的趨勢。PRP濃度在30%和50%時，細胞增殖最為明顯（圖 1）。

圖1 MTT法檢測培養(yǎng)第3、5、7天時各組細胞的增殖能力Fig.1 The proliferation of HSFs measured by MTT assay at the 3rd,5th and 7th day after culture

2.2 RT-PCR檢測膠原蛋白表達

RT-PCR結(jié)果顯示，目的基因COL1與COL3在50%PRP濃度組及陰性、陽性對照組中均顯著表達，3組間未見明顯差異（圖2）。

圖2 RT-PCR檢測目的基因COL1與COL3在50%PRP濃度組及陰性、陽性對照組中的表達Fig.2 The expression of COL1 and COL3 in the 50%PRP group,negative control group and positive control group

2.3 ELISA測量透明質(zhì)酸含量

隨細胞培養(yǎng)時間增加，HA量增加；伴隨PRP濃度的增加，HA量有增加的趨勢；在PRP濃度達到30%~50%時，增加幅度明顯（圖3）。

圖3 ELISA檢測培養(yǎng)第3、5、7天時各組細胞的HA含量Fig.3 The production of hyaluronic acid measured by ELISA at the 3rd,5th and 7th day after culture

3 討論

Annunziata等的研究顯示，PRP對齒齦成纖維細胞的活性具有促進作用；劉琪通過PRP處理生物膜，接種牙周韌帶成纖維細胞以促進其增殖。而本實驗研究PRP對皮膚成纖維細胞的體外作用，并且更著重于探索PRP對皮膚光老化的改善作用。

本實驗在第 3、5、7天使用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定細胞增殖效果，分別應(yīng)用RT-PCR測定膠原蛋白表達情況，ELISA測定HA功能變化，在體外探索PRP是否有直接改善皮膚光老化的可能。

MTT結(jié)果顯示，隨細胞培養(yǎng)時間延長，細胞增殖數(shù)量增加，伴隨PRP濃度的增加細胞增殖有增強的趨勢。PRP濃度在30%～50%時，細胞增殖最為明顯，提示PRP可在體外促進人皮膚成纖維細胞的增殖。

RT-PCR 結(jié)果顯示，含“PRP 濃度為 50%”、“+”、“-”3組均表達COL1與COL3，組間表達未見明顯差異。由于RT-PCR為半定量測定，對目的基因的表達量之間的對比缺乏一定的敏感性，因此，應(yīng)嘗試選用更具有敏感性的Real time-PCR進行檢測，以期達到更為精準的結(jié)果。

ELISA測定HA功能變化結(jié)果顯示，隨細胞培養(yǎng)時間增加，細胞產(chǎn)生的HA增加，伴隨PRP濃度的增加細胞合成的HA有增加的趨勢，在PRP濃度達到30%~50%時，其增加幅度明顯。該結(jié)果與MTT結(jié)果存在一定的相關(guān)性，我們推測，皮膚成纖維細胞和HA含量之間存在正相關(guān)。

因此，我們認為PRP有直接改善皮膚光老化的可能。但體外和體內(nèi)實驗結(jié)果并不一致。如上皮細胞和角質(zhì)細胞，在體外實驗中，PRP對其具有一定的選擇抑制作用。但動物實驗已證明，PRP可促進上皮化的進程并提高上皮化質(zhì)量。因此，我們的體外實驗雖然可以說明PRP對HSFs合成膠原與HA的功能有明顯促進效果，但無法證實其在體內(nèi)的效果。下一步需進行體內(nèi)實驗，擬將皮膚皺紋的減少、皮膚含水量的增加、效果持續(xù)時間作為體內(nèi)實驗的檢測指標。

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