晁 旭 崔亞亞 成 曉 魏敏慧 黨 琳 史海龍 楊新捷

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710069）

土貝母為葫蘆科植物，是一種廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥［1］，具有散結(jié)、消腫、解毒之功效［2］。采用現(xiàn)代提取工藝和分析方法已經(jīng)從土貝母分離出14種皂苷，其中土貝母皂苷Ⅰ、Ⅱ被證明具有抗腫瘤，抗炎和提高免疫力的作用［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，土貝母皂苷Ⅱ是最有希望用于臨床試驗(yàn)的化合物［5］。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析土貝母皂苷Ⅱ?qū)Π┣安∽兏渭?xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)；二乙基亞硝胺（DEN）購(gòu)自Sigma公司。土貝母皂苷Ⅱ由陜西中醫(yī)學(xué)院中藥教研室提供。

1.2 造模與給藥 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組6只。對(duì)照組動(dòng)物正常飼喂，模型組與治療組于第1日按200 mg/kg體質(zhì)量經(jīng)腹腔一次性注射1%DEN，10 d后按2 mL/kg體質(zhì)量第1次口服促癌劑（50%CCl4-橄欖油溶液），以后每隔3 d口服1次CCl4。實(shí)驗(yàn)第4周起，治療組同時(shí)每日按200 mg/kg體質(zhì)量灌服土貝母皂苷Ⅱ，共20 d。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）第16周取材進(jìn)行肝細(xì)胞分離，按Seglen［6］改良法進(jìn)行操作。大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，暴露肝臟，門靜脈插管，在無(wú)菌條件下以恒溫灌流泵先后灌注沖洗液和0.05%Ⅰ型膠原酶溶液各15 min。（2）收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液 （PBS）洗滌后，將細(xì)胞重懸于0.3 mL PBS，迅速注入預(yù)冷的75%乙醇，固定。測(cè)定時(shí)用PBS洗滌去掉乙醇，將細(xì)胞重懸于0.3 mL PBS中；加入0.6 mL碘化丙啶溶液，4℃避光染色15 min以上，經(jīng)50 μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，并以人末梢血淋巴細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，用EPIC Scoulter流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量，并分析細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物處于G1/G0期肝細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），而 S 期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。 與模型組相比，治療組肝細(xì)胞處于 G1/G0期肝細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），與對(duì)照無(wú)明顯差別；而S期細(xì)胞數(shù)也恢復(fù)至正常水平。

表1 各組動(dòng)物肝臟細(xì)胞G1/G0期及S期細(xì)胞數(shù)比較（%，±s）

表1 各組動(dòng)物肝臟細(xì)胞G1/G0期及S期細(xì)胞數(shù)比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 S期 G期對(duì)照組 5.53±1.34 28.52±2.15 n G1/G0期6 65.95±4.32模型組 18.08±1.02△△ 32.46±2.78 6 49.3±3.87△治療組 6 61.08±2.28* 7.82±2.78** 31.1±2.97

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)用FCM的DNA分析技術(shù)探討了土貝母皂苷Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞分化的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝細(xì)胞在正常狀態(tài)下，絕大多數(shù)處于G0期，極少數(shù)處于S期。模型組動(dòng)物經(jīng)DEN啟動(dòng)癌變后，使處于G1/G0期的肝細(xì)胞進(jìn)入S期，G1/G0期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，提示其DNA合成旺盛。治療組治療后的S期細(xì)胞較模型組明顯減少，而G1/G0期細(xì)胞增多，說(shuō)明土貝母皂苷Ⅱ可以阻止肝細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)程，造成G1期細(xì)胞的堆積。研究表明，如細(xì)胞被阻斷在G1期，更能有效地控制腫瘤的增殖［7］?？傊?，本研究結(jié)果顯示，土貝母皂苷Ⅱ?qū)δ[瘤的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，而且可能是通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞滯留于G1期，從而改變了腫瘤細(xì)胞的分裂過(guò)程，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

［1］中國(guó)科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1986：105-128.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2000年版：一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：143.

［3］YuL J，Ma RD，Wang YQ，et al.Potent antitumor activity and low toxicity of tubeimoside Ⅰ isolated from Bolbostemma paniculatum ［J］.Planta Med，1994，60（4）：204-208.

［4］Yu LJ，Yu TX，Ma RD.Inhibition of the tumor promoting action of 12-O-tetradecanoylphorbo l-13-acetate by tubeimosideⅢisolated from Bolbostemma paniculatum［J］.Carcinogenesis，1995，16（12）：3045-3048.

［5］楊萍，于廷曦，馬潤(rùn)娣，等.土貝母皂苷誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡［J］.癌癥，2002，21（4）：346-350.

［6］Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells.In：Prescott DM.Methodsin Cell Biology［M］.New York：Academic Press，1987：29-83.

［7］楊兼輝.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)與腫瘤藥物治療.朱世能.腫瘤基礎(chǔ)理論［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986：177-180.