于春水 蘇江維 胡 珍

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000）

姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質(zhì)。動物實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗炎及抑制腫瘤生長等作用［1］。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖，阻止該細(xì)胞在G2-M期，其作用呈濃度依賴性，同時姜黃素還具有下調(diào)T24細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白A（cyclinA），上調(diào)細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑P21 WAF1/CIP1，降低環(huán)氧酶-2 mRNA及其蛋白表達(dá)的作用［2］。本研究將不同濃度的姜黃素作用于培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，觀察其對HaCaT細(xì)胞增殖及在缺氧培養(yǎng)下對HaCaT細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表達(dá)的影響，探討姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖及HIF-1α的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HaCaT細(xì)胞株（武漢大學(xué)典型物保藏中心），HIF-1α兔抗人單克隆抗體（Sigma公司）。姜黃素（Sigma公司），純度＞96%，用DMSO稀釋，等量分裝，-20℃保存。用時用培養(yǎng)液稀釋為 0.1%（v/v），以不影響細(xì)胞的生長。

1.2 姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖抑制的檢測 （MTT法） HaCaT細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每2～3日換液、傳代。取對數(shù)期生長的HaCaT細(xì)胞，以1.0×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，24 h 后棄培養(yǎng)液，處理組細(xì)胞分別加入 10、20、30 μmol/L的姜黃素，每孔100 μL，對照組僅用DMEM處理，每孔均為100μL，設(shè)3個復(fù)孔。常規(guī)設(shè)立對照組，加入與姜黃素等體積的培養(yǎng)液于對照組內(nèi)。于培養(yǎng)24 h時，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h，棄上清，然后每孔加入 DMSO 100 μL，沉淀充分溶解后，用酶標(biāo)儀測定570 nm波長下OD值，生長抑制率＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值）×100%。

1.3 HaCaT細(xì)胞的缺氧處理與免疫組化檢測 將HaCaT細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液以每孔1×104的密度小心接種至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，然后每孔加入2.0 mL的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為：50 U/mL 青霉素，50 mg/mL 鏈霉素，1.25 mg/mL 兩性霉素 B，于37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至60%融合時，再將細(xì)胞置于 37℃，含有1%O2，5%CO2和94%N2的缺氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，處理組細(xì)胞分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的姜黃素，每孔 2000 μL，對照組僅用 DMEM處理，培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片做隨后的實(shí)驗(yàn)，每組均設(shè)3個復(fù)孔。在用姜黃素處理HaCaT細(xì)胞時，保持避光。HIF-1α蛋白在HaCaT細(xì)胞的檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取出上述蓋玻片，按照常規(guī)免疫組化操作步驟進(jìn)行，陽性細(xì)胞為有棕黃色顆粒狀沉淀。免疫組化結(jié)果采用德國LeicaQ570公司的圖像分析儀及圖像分析系統(tǒng)軟件對其進(jìn)行半定量分析，每張蓋玻片隨機(jī)選取3個視野，每個視野選取10個細(xì)胞測量其平均灰度值，圖像分為0～255灰度級，染色結(jié)果越淡，灰度值越高。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖的影響 見表1。姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用加強(qiáng)，并呈顯著的量效依賴型關(guān)系。

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

與對照組比較，*P＜0.01。 下同。

組 別 OD值對照組 1.234±0.03姜黃素 10 μmol/L 組 0.532±0.05*姜黃素 20 μmol/L 組 0.454±0.04*姜黃素 30 μmol/L 組 0.408±0.02*

2.2 HaCaT細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后HIF-1α蛋白表達(dá)比較 HaCaT細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)后，HIF-1α蛋白的免疫組化著色在對照組呈陽性表達(dá)（圖1）；而在姜黃素處理后，HaCaT細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)減少，同時隨著姜黃素濃度的增加，HaCaT細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)逐漸減弱，染色顯示，陽性主要位于細(xì)胞的胞漿內(nèi)。姜黃各組與對照組比較，有顯著差異（P＜0.01），并且灰度分析的結(jié)果與光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果相一致（表2）。

圖1 各組HaCaT細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后HIF-1α蛋白表達(dá)（×200）

表2 姜黃素對HaCaT細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)影響（n=3，±s）

表2 姜黃素對HaCaT細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)影響（n=3，±s）

組 別 灰度值對照組 131.12±3.21姜黃素 10 μmol/L 組 192.13±3.13*姜黃素 20 μmol/L 組 201.16±2.14*姜黃素 30 μmol/L 組 240.13±4.15*

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的生長，因此，姜黃素在防治腫瘤等方面有明顯的作用，其良好的抗突變和抗癌作用使其成為一種很有應(yīng)用前景的抗癌藥物［3］。而銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖在某種程度上與腫瘤細(xì)胞的表現(xiàn)類似。

HIF-1α是HIF-1異源二聚體結(jié)構(gòu)之一，屬于bHLH-PAS家族成員。有研究報道，HIF-1α在銀屑病皮損中的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及其真皮乳頭層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈過度表達(dá)［4］。近來的研究顯示，在缺氧情況下，HIF-1α在HaCaT細(xì)胞的表達(dá)增高［5］。

本研究結(jié)果顯示，以不同濃度的姜黃素作用于HaCaT細(xì)胞后均能抑制培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞增殖，并且結(jié)果呈現(xiàn)量效依賴關(guān)系，同時，隨著姜黃素濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)，該結(jié)果與對照組相比具有顯著差異 （P＜0.01）；姜黃素能抑制缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)，并呈量效依賴關(guān)系，與對照組相比，有顯著差異（P＜0.01）。有研究認(rèn)為，銀屑病皮損區(qū)可能存在局域缺氧［6］，銀屑病皮損表皮HIF-1α表達(dá)增高，認(rèn)為可能與皮損局部缺氧有關(guān)［7］。因此，缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞與銀屑病、腫瘤細(xì)胞的情況有些類似。

有研究報道，HIF-1α與胸腺瘤的發(fā)生有關(guān)系［8］。銀屑病和惡性腫瘤都表現(xiàn)為具有特征性的細(xì)胞過度增殖和局域性的缺氧表現(xiàn)［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素具有抑制HaCaT細(xì)胞的增殖及HIF-1α蛋白的表達(dá)的作用，如用于銀屑病治療中，可以改善銀屑病表皮的異常增殖現(xiàn)象。因此，姜黃素可能對于表現(xiàn)為表皮異常增殖的一類疾病效果滿意。在銀屑病中局部表皮細(xì)胞的異常增殖增加了該處的氧的消耗，而棘層的肥厚可以進(jìn)一步導(dǎo)致皮損處氧供應(yīng)的障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，HaCaT細(xì)胞表達(dá)HIF-1α僅是蛋白水平的增加，而在mRNA水平其表達(dá)是穩(wěn)定的［9］。這一結(jié)論與我們的研究結(jié)果相一致。姜黃素對HaCaT細(xì)胞中的HIF-1α mRNA具體作用如何，有待進(jìn)一步深入的研究。由于HaCaT細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)的條件下與銀屑病表皮所處的情況有些類似，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素具有抑制缺氧培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)的作用。因此，筆者認(rèn)為，姜黃素可推薦用于銀屑病以及表現(xiàn)為表皮異常增殖的一類疾病的治療，使其異常增殖的表皮得以恢復(fù)正常。

［1］龍明智，陳磊磊.姜黃素的藥理作用［J］.國外醫(yī)學(xué)：中醫(yī)中藥分冊，2003，25（5）：270-275.

［2］Park C，Kim GY，Kim GD，et al.Induction of G2/Marrest and inhibition of cyclooxygenase 2 activity by curcumin in human bladder cancer T24cells［J］.Oncology reports， 2006， 15（5）：1225-1228.

［3］許建華，趙蓉，柯丹如，等.姜黃素的體外抗癌作用及其水溶液的穩(wěn)定性［J］.中藥藥理與臨床，1998，14（5）：415-417.

［4］Rosenberger C，Solovan C，Rosenberger A，et al.Upregulation of hypoxia-inducible factors in normal and psoriatic skin［J］.J Invest Dermatol，2007， 127（10）：2445-2452.

［5］Nys K，Van LA，Michiel C，et al.A p38 （MAPK）/HIF-1 pathway initiated by UVB irradiation is required to induce Noxa and apoptosis of human keratinocytes［J］.J Invest Dermatol，2010， 130（9）：2269-2276.

［6］Tovar LE，Cancino JC，Garsia VF，et al.Underexpression of VHL and over-expression of HDAC-1，HIF-l alpha，LL-37，and IAP-2 in affected skin biopsies of patients with psoriasis［J］.Int J Dermatol， 2007，46（3）：239-246.

［7］楊海龍，栗玉珍，孫瑞，等.HIF-1α、VEGF在銀屑病皮損中的表達(dá)及意義［J］.醫(yī)學(xué)信息，2011，24（1）：340-342.

［8］王湛，黃壯士，蘇彥河，等.HIF-1α、Caspase-3及 Survivin在胸腺瘤中的表達(dá)及意義［J］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2009，3（5）：717-722.

［9］楊井，陶娟，李延，等.缺氧對 HaCaT細(xì)胞 HIF-1α、GLUT-1表達(dá)的影響及與細(xì)胞增殖的關(guān)系［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2009，23（10）：621-623.