張新春 黃 燕

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

在腦缺血性損傷機(jī)制中，自由基連鎖反應(yīng)被認(rèn)為是造成腦組織損害的重要機(jī)制之一，缺血后再灌注可促發(fā)自由基的連鎖反應(yīng)，加重缺血性損傷，造成嚴(yán)重的神經(jīng)元壞死［1］。抑制自由基的產(chǎn)生及自由基清除對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用益氣活血中藥（芎芪合劑）對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，從其對(duì)大鼠缺血腦組織中氧自由基損傷相關(guān)指標(biāo)的影響來探討芎芪合劑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與試劑 包括眼科剪、組織剪、玻璃分針、鋼尺、刀柄、刀片、眼科鑷（彎）、無齒鑷、持針器、小角針、手術(shù)線、無菌彎盤、紗布、棉球、漁線、酒精燈、手術(shù)臺(tái)、手術(shù)燈等。超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 藥物 芎芪合劑，規(guī)格為 10 mL/支，呈棕黃色，澄清透明，由黃芪總皂苷 1.0 g、芍藥總苷 0.90 g、磷酸川芎嗪 0.10 g 溶于9 mL注射用水，以1%NaOH調(diào)節(jié)pH至8，定容至10 mL得濃縮藥液，相當(dāng)于生藥：蒙古黃芪50 g，赤芍 30 g，川芎10 g，由廣東省中醫(yī)院制劑室提供。

1.4 模型制備 參照Koizumi［2］方法制成大鼠大腦中動(dòng)脈缺血-再灌注模型。術(shù)后2 h觀察大鼠的癥狀和體征，參照Zealonga評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度的5級(jí)4分法標(biāo)準(zhǔn)［3］，0分為無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展左側(cè)前爪；2分為中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向左側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。評(píng)分在1～3分為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組可出現(xiàn)同側(cè)Horner征，但無左側(cè)肢體癱瘓。

1.5 分組及給藥 將大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，芎芪合劑組，每組10只。栓塞后1.5 h各組開始給藥：（1）假手術(shù)組、模型組腹腔注射生理鹽水 2 mL/200 g；（2）芎芪合劑組腹腔注射中藥稀釋液2 mL/200 g，為臨床用量10倍（以臨床用量200 mg/70 kg計(jì)）。栓塞后2 h拔出線栓形成再灌注。芎芪合劑組再灌注12 h后腹腔注射芎芪合劑稀釋液2 mL/200 g，假手術(shù)組、模型組再灌注12 h后腹腔注射生理鹽水2 mL/200 g。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 在缺血2 h再灌注24 h評(píng)分后，各組大鼠斷頭取腦，完整剝?nèi)∧X組織，用冷生理鹽水將表面的血液沖洗干凈，去除嗅球、小腦和低位腦干，取右側(cè)（缺血側(cè)）腦組織用于制作勻漿液。腦組織置于玻璃勻漿器中，加入9倍量的冷生理鹽水，手工勻漿，充分研磨3～5 min，使組織勻漿化，將制備好的10%勻漿用離心機(jī)于4℃，3000 r/min離心15 min，取上清液于-75℃冰箱中保存待測(cè)。以上所有手工操作均在冰盤上進(jìn)行。

1.6.1 SOD含量測(cè)定 將10%腦勻漿用生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿，4 ℃，4000 r/min 離心 10 min，取上清30 μL，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量，按試劑盒說明操作。

1.6.2 MDA含量測(cè)定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定。將10%腦勻漿于 4℃，4000 r/min離心 10 min，取上清 100 μL，采用TBA比色法測(cè)定MDA含量，按試劑盒說明操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，然后用posthoc檢驗(yàn)中的LSD法（方差齊時(shí)）或Dunnett’s T3（方差不齊時(shí)）作多個(gè)均數(shù)間的兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色正常。模型組和芎芪合劑組術(shù)后出現(xiàn)精神萎頓，倦怠嗜唾，四肢蜷縮，活動(dòng)性差，對(duì)外界敏感性下降，自發(fā)活動(dòng)減少，毛色光澤暗淡，舌質(zhì)明顯絳紫或暗淡等。提示大鼠在腦缺血再灌注后出現(xiàn)了類似于腦梗死“氣虛血瘀”的病理狀態(tài)［4］。

2.2 芎芪合劑對(duì)MCAO再灌注后大鼠腦組織中SOD含量的影響 見表1。模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中SOD含量較假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；芎芪合劑組大鼠缺血側(cè)腦組織中SOD含量較模型組提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示芎芪合劑能提高大鼠缺血側(cè)腦組織中SOD含量，并使之趨向于正常。

表1 各組大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比較（±s）

表1 各組大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比較（±s）

與芎芪合劑組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組 別 n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）假手術(shù)組 10 146.88±21.54▲ 3.41±1.29▲模型組 10 87.81±19.51△ 5.06±1.48△芎芪合劑組 10 137.50±42.51▲ 3.68±1.33▲

2.3 芎芪合劑對(duì)MCAO再灌注后大鼠腦組織中MDA含量的影響 見表1。模型組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），提示腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA含量增高；芎芪合劑組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示芎芪合劑組大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA含量較模型組減低；芎芪合劑組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），提示芎芪合劑能降低大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA含量，并使之趨向于正常。

3 討 論

腦脈瘀阻是腦梗死發(fā)病過程中的關(guān)鍵病理機(jī)制，血運(yùn)重建再灌注治療可在短時(shí)間內(nèi)“袪除瘀阻”，迅速恢復(fù)腦部血液供應(yīng)，但在治療后極易出現(xiàn)腦缺血-再灌注損傷的情況。依據(jù)黃燕教授的臨床經(jīng)驗(yàn)，腦梗死血運(yùn)重建治療后腦缺血-再灌注損傷以氣虛、血瘀為主要病機(jī)，因此，益氣活血法是腦缺血-再灌注損傷主要治療法則。本研究所用藥物即是根據(jù)導(dǎo)師的經(jīng)驗(yàn)思路，采用益氣活血的治療原則，選取黃芪、赤芍、川芎的有效部位：黃芪總苷、赤芍總苷、川芎嗪組成芎芪合劑，以期能夠減輕大鼠腦缺血-再灌注損傷的程度。

人體正常代謝也產(chǎn)生自由基。但體內(nèi)存在相應(yīng)的自由基清除酶，如SOD等，產(chǎn)生與清除間動(dòng)態(tài)平衡，不發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)和組織損傷［5］。但在腦缺血、外傷等病理?xiàng)l件下，清除酶活性降低，自由基產(chǎn)生增多，動(dòng)態(tài)平衡嚴(yán)重破壞，則可啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng)，造成缺血損傷進(jìn)一步加重。脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量可以反映機(jī)體受自由基攻擊的程度。而SOD是體內(nèi)主要自由基清除酶，能夠有效地清除并終止超氧陰離子引發(fā)的連鎖反應(yīng)［6］。MDA顯著升高，說明腦組織缺血后氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)；SOD下降可能是增強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)消耗了過多的抗氧化酶，氧化-抗氧化平衡被打破。因此，SOD和MDA含量的變化可間接反映自由基在體內(nèi)的生成和體內(nèi)抗氧化防御作用的功能狀況。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中SOD含量降低；芎芪合劑能提高大鼠缺血側(cè)腦組織中SOD含量，并使之趨向于正常。而腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA含量增高；芎芪合劑能減低大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA含量，并使之趨向于正常。以上結(jié)果提示，在腦缺血再灌注損傷的過程中，芎芪合劑能夠通過升高腦組織中SOD的含量，同時(shí)降低MDA的含量來達(dá)到抗氧自由基氧化損傷的作用，從而對(duì)缺血再灌注腦組織產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

［1］馮加純.細(xì)胞內(nèi)鈣超載和自由基與遲發(fā)性神經(jīng)元壞死［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1993，10（3）：188-189.

［2］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］.Stroke，1986，8（1）：1-8.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］郭建隊(duì)，楊秀清，陳梅.氣虛血瘀證腦梗死動(dòng)物模型的制作［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2005，25（3）：1-3.

［5］Suzuki J.Chemiluminescence in hypoxic brain［J］.Stroke，1988，19：65.

［6］Kinute Y，Kikuchi H，Ishikawa M，et al.Lipid peroxidation in focal cerebral ischemial［J］.Neurosurg，1989，7（3）：420.