范晶晶

（1.濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061）

子宮肌瘤的發(fā)病率居女性生殖器官良性腫瘤的首位［1］，據(jù)衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)：我國20%～30%成年女性患有子宮肌瘤，每年新發(fā)病人數(shù)在200萬以上［2］。近年研究表明，子宮肌瘤等疾病的病變中主要細(xì)胞成份是子宮肌層的平滑肌細(xì)胞。小鼠作為實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，培養(yǎng)其子宮平滑肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對于研究子宮平滑肌細(xì)胞生長、分化、各種致病因素所致子宮病理改變的發(fā)病機(jī)制和藥物治療的副作用等方面有著重要意義。由于小鼠子宮類型屬于長雙角子宮［3］，與其它動(dòng)物相比子宮角直徑小取材量少，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)操作難度大、失敗率高，而傳統(tǒng)的酶消化法分離培養(yǎng)的效果差。為了提高小鼠子宮平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率和可行性，我們在參照國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道［4－9］的基礎(chǔ)上，通過對原有的酶消化法進(jìn)行改良，建立了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、細(xì)胞純度高的新分離培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7～8周齡雌性昆明白小鼠購于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

（2）試劑與儀器：胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM、F12培養(yǎng)基購于GIBCO公司；青霉素、鏈霉素購于華北制藥有限公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程公司；平滑肌肌動(dòng)蛋白Mouseanti－Actin（英國Novacastra公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（GAM－FITC，美國Zymed公司），Hoechst333258（美國MO公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括：普通冰箱、CO2培養(yǎng)箱（Sanyo）、解剖顯微鏡（Motic）、熒光顯微鏡（Leica）、倒置顯微鏡（Leica）、超凈工作臺、高速離心機(jī)、恒溫水浴箱，恒溫臺。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮平滑肌細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

將小鼠麻醉處死，迅速取出子宮放于預(yù)冷Hanke’s液（0～4℃）中，沖洗2～3次，以剪刀將周圍組織去除干凈，將子宮外膜用刀片輕輕刮掉，將子宮縱向剖平鋪，內(nèi)膜面朝上，用鑷子固定住一端，從固定處開始用一次性1mL注射器的針頭（打彎成30°角）作為分離器輕輕將子宮內(nèi)膜和基質(zhì)部分刮掉（分離過程見圖1），將內(nèi)膜和基質(zhì)去除干凈的子宮平滑肌條剪碎至1mm3，用3mL 0.25%的膠原酶和0.25%胰酶混合消化液37℃水浴震蕩消化1h，2mL有血清DMEM－F12培養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，200目細(xì)胞篩過濾吸取懸液，再通過400目細(xì)胞篩，收集濾液1000rpm／10min離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗2次，去除細(xì)胞碎片，接種于35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。臺盼蘭排斥試驗(yàn)查細(xì)胞存活率大于90%［5］。用20%FCSDMEM－F12培養(yǎng)液，放入37℃、95%濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換一次液。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、排列方式及生長特點(diǎn)等。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗2遍，－20℃預(yù)冷甲醇處理20min，用封閉液1%BSA＋0.2%TritonX－100封閉45min。加入平滑肌肌動(dòng)蛋白（Mouse anti－Actin，1：50）一抗，4℃過夜。次日平衡至室溫，加FITC標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，用Hoechest33258復(fù)染，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，暗場下以胞質(zhì)出現(xiàn)亮綠色為陽性結(jié)果，同時(shí)計(jì)算陽性百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠子宮平滑肌組織的分離與平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的建立

圖1 子宮平滑肌分離過程

取小鼠的子宮，分離出平滑肌，通過光鏡，對分離過程進(jìn)行了觀察（見圖1）。采用本文所述的注射器針頭分離方法可以將子宮平滑肌與內(nèi)膜基質(zhì)完全分離，為以后保證細(xì)胞培養(yǎng)純度做好了基礎(chǔ)。

采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合消化法消化細(xì)胞。體外培養(yǎng)3－4天后形成子宮平滑肌細(xì)胞單層，約2周后細(xì)胞融合成片。倒置相差顯微鏡下觀察單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形或帶狀，有多個(gè)細(xì)胞突起，胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)密度高，不透明，平行排列成束，部分重疊，表現(xiàn)為典型的“谷”、“峰”狀生長（見圖2A）。

2.2 子宮平滑肌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

圖2 子宮平滑肌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

為了進(jìn)一步鑒定單層細(xì)胞中平滑肌細(xì)胞的純度，用平滑肌細(xì)胞特異的肌動(dòng)蛋白（α－Actin）進(jìn)行免疫熒光染色。染色結(jié)果表明：平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)，綠色熒光為陽性染色，主要分布在胞質(zhì)區(qū)域。為了進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)陽性率，免疫染色后用Hoechst333258對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染。細(xì)胞核在復(fù)染后呈現(xiàn)為藍(lán)色，子宮平滑肌細(xì)胞呈梭形，胞漿豐富，核大圓形或橢圓形。顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)不同的區(qū)域（×100），數(shù)出單位面積內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和α－Actin免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，細(xì)胞單層中平滑肌細(xì)胞純度在98%以上。

3 討論

子宮平滑肌細(xì)胞的收縮、舒張、增殖、纖維化與婦產(chǎn)科疾病密切相關(guān)。因此，體外培養(yǎng)子宮平滑肌細(xì)胞就成為研究這些疾病及相關(guān)藥物藥理的一種重要實(shí)驗(yàn)材料。本研究成功運(yùn)用自制針頭分離器將平滑肌組織與內(nèi)膜基層完全分離，并使用膠原酶和胰酶混合消化法、采用20%FCSDMEM／F12培養(yǎng)基對小鼠子宮平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，所培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長，呈現(xiàn)梭形、成束的平滑肌細(xì)胞平行排列，部分細(xì)胞重疊生長達(dá)多層，部分區(qū)域可見典型的“峰一谷”樣生長。α－Actin免疫熒光細(xì)胞染色陽性，此結(jié)果表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為典型的平滑肌細(xì)胞，也說明本方法培養(yǎng)的小鼠子宮平滑肌細(xì)胞，雖脫離了原有機(jī)體生長環(huán)境，仍具有平滑肌細(xì)胞的特性。該分離方法簡單、快速、成本低、易于掌握、分離純度高，細(xì)胞增殖迅速。

［1］Parazzini F，Chiafarino F，Polverion G，etal.Uterine fibroids risk and history of selected medical conditions linked with femal hormones［J］.Eur J Epidemiol，2004，19（3）：249－253.

［2］張獻(xiàn)懷.中國成年女性子宮肌瘤年新發(fā)病人數(shù)在200萬以上［N］.人民日報(bào)，2011－07－22（海外版）。

［3］Geeene E C.Anatomy of the rat［M］.New York：Hafner Publishing Co，1959.

［4］Ross R.The smooth muscle cell II.Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers［J］.Cell Biol，1971，50（1）：172－186.

［5］Casey M L，MacDonald P C，Mitchell M D，etal.Maintenance and characterization of human myometrial smooth muscle cell in monolayer cuhure［J］.In vitro，1984，20（5）：396－403.

［6］黃柏英，張瑜.人子宮平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，12（3）：479－481.

［7］曾潤清，劉庚貴，劉惠萍，等［J］.兔子宮平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14（2）：267－269.

［8］錢桂生，李淑平.大鼠細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的新方法［J］.中國臨床解剖學(xué)雜志，2000，18（3）：282－283.

［9］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安：世界圖書出版西安公司，2004：31.