王慶忠

（1.山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061；2.濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

生姜（Zingiber officinale）是藥食同源植物，具有驅(qū)風(fēng)散寒、健胃止吐、抑菌殺蟲(chóng)、抗腫瘤等作用。生姜醇提取物（Zingiber officinale extraction in alcohol，CCM）含姜黃素等多種物質(zhì)，其中的姜黃素為姜的重要活性成分之一，廣泛用于食品添加劑和著色劑，具有抗HIV、抗利什曼原蟲(chóng)、抗細(xì)胞畸變、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用[1-2]。尤其是生姜醇提取物的抗癌活性在近年來(lái)受到廣泛重視。研究表明，生姜醇提取物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌等各種癌癥的發(fā)生有抑制和治療作用[3-11]。但關(guān)于生姜醇提取物對(duì)精子發(fā)生和睪丸腫瘤的作用，至今未見(jiàn)報(bào)道。TM4細(xì)胞株來(lái)源于小鼠睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells），在體外培養(yǎng)中具有支持細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的特性。通過(guò)研究生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的影響，可反映其對(duì)哺乳動(dòng)物和人的生精作用和睪丸腫瘤發(fā)生的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、二甲基亞楓（DMSO）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM、胰蛋白酶（Trypsin）、明膠、MTT（甲基四氫葉酸鹽）等試劑均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；TUNNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為凱基生物有限公司產(chǎn)品；其它一般試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器包括細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（北京鼎國(guó)生物有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Precision Scientific Inc.）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、An Thos TH2酶標(biāo)儀（Austria公司）等。

1.2 細(xì)胞株與培養(yǎng)條件

小鼠支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生殖生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

細(xì)胞培養(yǎng)基是以DMEM為基本培養(yǎng)液，添加2mM L-谷氨酰胺、5%FBS、100unit／ml青霉素和100ug／ml鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%CO2和飽和濕度條件下。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將TM4細(xì)胞株分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組以5種不同濃度的生姜醇提取物進(jìn)行處理。

1.3 生姜醇提取物的制備

將2000g生姜粉碎后，加入60%的乙醇500ml，置入65℃恒溫水浴中，作用12小時(shí)。然后過(guò)濾，棄去殘?jiān)?，浸提液置?5℃干燥箱中烘干。稱重浸出物，并配制成0.1mg／ml的母液。

1.4 MTT比色法檢測(cè)TM4細(xì)胞活性

MTT能被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM4細(xì)胞，制成5×104cell／mL細(xì)胞懸液，以每孔200μL接種于96孔板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，棄掉培養(yǎng)基，依次以終濃度為20、40、60、80、100μg／mL的生姜醇提取物的培養(yǎng)液分別加入96孔板的各孔內(nèi)，每一濃度設(shè)5個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)對(duì)照組（不加藥組）及空白組（僅加培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入5g／L的MTT20μL，培養(yǎng)箱中孵育4h，然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO液200μL，將培養(yǎng)板置于微孔板蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解，最后在酶標(biāo)儀上于4920nm的波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度OD值。通過(guò)下式計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率：

細(xì)胞存活率＝[（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）／（對(duì)照組OD值勤-空白組OC值）]×100%

抑制率＝100%-存活率

試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。結(jié)果用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 原位末端標(biāo)記法（TUNNEL）檢測(cè)TM4細(xì)胞凋亡

TM4細(xì)胞的處理同上，所不同的是制作成細(xì)胞爬片，載玻片常規(guī)干熱滅菌處理，用前以0.2明膠包被10分鐘，然后用PBS洗滌3次后接種細(xì)胞。細(xì)胞的染色按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟如下：

①取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌5min×2次；②加入3%過(guò)氧化氫室溫下孵育20min，PBS洗滌5min×3次；③0.1蛋白酶K在4℃下作用30min，PBS洗滌5min×3次；④加入反應(yīng)混合液，37℃濕盒內(nèi)孵育60min，PBS洗滌5min×3次，然后加50μLPOD，繼續(xù)孵育60min，PBS洗滌5min×3次；⑤加入50μL新配制的DAB顯色試劑，作用3-5min，自來(lái)水洗，置鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察到生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的增殖有抑制作用

光鏡下，對(duì)照組的TM4細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)呈梭形或多角形，胞核明顯。20μg／mL的生姜醇提取物處理組的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化；40μg／mL的醇提取物處理組可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)不良，某些細(xì)胞的胞體變小，變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少；60μg／mL的醇提取物處理組中可觀察到大量的細(xì)胞脫壁，輪廓不清，細(xì)胞膜破潰，聚集成細(xì)胞團(tuán)，以及少量的細(xì)胞碎片。因此，隨處理劑量的增加，生姜醇提取物明顯抑制TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖（見(jiàn)圖1）。

圖1 光鏡下生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的影響（×260）

2.2 MTT法檢測(cè)出生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的增殖有抑制作用

MTT法測(cè)定的不同濃度的熟地黃醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞株生長(zhǎng)與增殖的影響見(jiàn)表1。從表中各不同濃度的生姜醇提取物對(duì)細(xì)胞的抑制率可以看出，20μM／mL生姜醇提取物處理的TM4細(xì)胞與對(duì)照組比較沒(méi)有顯著差異，40μg／mL生姜醇提取物處理組對(duì)TM4細(xì)胞增殖的抑制作用與對(duì)照組比較已經(jīng)有較明顯的差異，隨著處理濃度的增大，這種抑制作用越來(lái)越強(qiáng)，呈劑量間依賴性。處理濃度達(dá)到100μg／mL時(shí)，TM4細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖已被基本抑制。

表1 MTT法檢測(cè)各濃度生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞增殖的影響±S）

表1 MTT法檢測(cè)各濃度生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞增殖的影響±S）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05。

組別 對(duì)照組 CCM 處理組劑量（μΜ／mL）0.0 20 40 60 80 100抑制率 1.29±0.03 3.84±0.24 21.2±0.2＊ 37.7±0.1＊ 51.2±0.1＊ 74.6±0.11＊

2.3 TUNNEL法檢測(cè)到生姜醇提取物誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡

通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CCM具有誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡的作用。在20μM／mL生姜醇提取物處理組檢測(cè)載片上，偶見(jiàn)凋亡的細(xì)胞，說(shuō)明這一濃度的生姜醇提取物處理對(duì)TM4細(xì)胞沒(méi)有影響；40μM／mL生姜醇提取物處理組的載片上可觀察到較多的凋亡細(xì)胞，隨著處理濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增大（見(jiàn)圖2，其它處理組的圖片未展示）。凋亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)與分析也表明，40μM／mL生姜醇提取物處理組與對(duì)照組比較有顯著差異（見(jiàn)表2）。

圖2 光鏡下觀察的生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的影響（TUNNEL法）

表2 不同濃度的生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的凋亡指數(shù)±S，n＝3）

表2 不同濃度的生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的凋亡指數(shù)±S，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05。

生姜醇提取物處理濃度（μg／mL） TM4細(xì)胞凋亡指數(shù)（﹪）對(duì)照組1.87 20 5.01 40 28.01＊60 37.30＊80 56.63＊100 73.08＊＊

3 結(jié)論與討論

生姜醇提取物具有多方面的藥理作用。尤其是作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種潛在的第3代抗惡性細(xì)胞增殖藥[4-11]。許多研究表明，生姜醇提取物具有確切的抗細(xì)胞增殖活性[2，8]。但生姜醇提取物對(duì)睪丸中支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的影響作用還未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，利用小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4作為研究材料，通過(guò)光鏡下的細(xì)胞形態(tài)觀察、MTT法測(cè)定細(xì)胞活性和TUNNEL法三種方法研究生姜醇提取物對(duì)TM4細(xì)胞的影響。研究結(jié)果表明，生姜醇提取物抑制TM4細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與報(bào)道的生姜醇提取物對(duì)其它類型的細(xì)胞的影響是一致的，40μM／mL的生姜醇提取物即能顯著抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-8]，并呈劑量依賴效應(yīng)。TM4細(xì)胞來(lái)源于小鼠的睪丸支持細(xì)胞，既具有支持細(xì)胞的特殊性，又具有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。我們這一研究的結(jié)果也表明，生姜醇提取物對(duì)睪丸癌細(xì)胞的增殖有抑制和誘導(dǎo)其凋亡的作用。因此，生姜醇提取物可以作為預(yù)防和治療睪丸癌的一種藥物。但生姜醇提取物誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

[1]崔晶，翟光喜，婁紅祥.姜黃素的研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2005，3（2）：108-119.

[2]羅金香，丁偉，王永強(qiáng)，等.姜黃素雙肟酯衍生物的合成與生物活性研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，30（8）：52-56.

[3]王玉玲，吳振，張喜軒.姜黃素類化合物的抗腫瘤活性[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，5（4）：380-381.

[4]趙承光，楊菊，梁棟樓，等.新型含氟姜黃素類似物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性[J].有機(jī)化學(xué)，2010，30（2）：289-294.

[5]林友文，陳莉敏，周有青，等.姜黃素類似物的微波合成及抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)新藥雜志，2010，19（7）：622-624.

[6]黃贊松.姜黃素對(duì)消化系腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：383-385.

[7]田斌強(qiáng)，趙應(yīng)梅，王德貴，等.生姜醇提取物對(duì)大鼠膀胱腫瘤的預(yù)防與治療作用[J].腫瘤，2011，（11）：1004-1009.

[8]龔萍，李紅霞，張素梅.姜黃素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株skov-3生長(zhǎng)的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（1）：18-21.

[9]Lin J K，Pan M H，Lin-Shiau S Y.Recent studies on the biofunctions and biotransformations of curcumin[J].Biofactors，2000，13（1／4）：153-158.

[10]Bulku E，Stohs S J，Cicero L，et al.Curcumin exposure modulates multiple pro-apoptotic and anti-apoptotic signaling pathways to antagonize acetaminophen-induced toxicity[J].Curr Neurovasc Res，2012，9（1）：58-71.

[11]Attia H N，Al-Rasheed N M，Al-Rasheed N M，et al.Protective effects of combined therapy of gliclazide with curcumin in experimental diabetic neuropathy in rats[J].Behav Pharmacol，2012，23（2）：153-61.