關(guān)洪亮,熊 倩,余訓(xùn)民,李慶新
(武漢工程大學(xué)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院,湖北 武漢 430074)
隨著人們對絲氨酸生理作用的深入認識和醫(yī)藥保健事業(yè)的不斷發(fā)展,醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)對絲氨酸的需求量正迅速擴大.雖然L-絲氨酸屬于非必需氨基酸,但它卻具有許多重要的生理功能及用途,在醫(yī)藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應(yīng)用.因此,測定混合氨基酸中絲氨酸的含量對絲氨酸的開發(fā)利用具有重要意義.
α-氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱,反應(yīng)后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮,再與水合茚三酮反應(yīng)生成紫紅色或藍色物質(zhì),如圖1.脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì).絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色的縮合物質(zhì)[1-3],且其顏色隨著絲氨酸的含量變化而有所不同.
圖1 α-氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)Fig.1 Colour reaction of α-amino acid and ninhydrin
上述反應(yīng)生成的紫紅色縮合物顏色的深淺還與反應(yīng)的pH、顯色劑的用量、反應(yīng)的溫度及時間有關(guān).本文利用顯色反應(yīng),采用比色法定量檢測絲氨酸并探討了最佳的反應(yīng)條件.
722E可見光分光光度計;層析濾紙;毛細管;25 μL微量進樣器;薄層色譜展開缸(規(guī)格100×100);干燥箱;帶塞玻璃試管(比色管).
1g/L的L-絲氨酸標準溶液:稱取0.1 g絲氨酸溶于100 mL去離子水中.
展層劑:按照“正丁醇∶95%乙醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1∶2”比例配制,均為AR.
0.1%茚三酮溶液:稱取0.1 g茚三酮溶于95%乙醇中,定容至100 mL,均為AR.
層析液(0.1%茚三酮-展層劑):每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.
洗脫液:按照“V(0.1%CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38”比例配制.稱取0.156 5 g CuSO4·5H2O溶于去離子水中,定容至100 mL,配制成0.1%CuSO4溶液.
待測樣品:氨基酸混合液,含有絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等.
1.2.1 茚三酮法定性檢測絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min,使缸內(nèi)環(huán)境達到平衡,在距濾紙下端2 cm處劃一橫線,將待測樣品用毛細管點樣于橫線上,點樣半徑不要超過2 mm,將L-絲氨酸標準溶液用毛細管點樣于距待測樣品點1.5 cm處的橫線上,點樣半徑不要超過2 mm.待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開缸中,下端1 cm左右浸入層析液中,上端高出展開缸的部分延展開缸邊緣折疊掛于展開缸上,確保濾紙不與展開缸內(nèi)壁接觸,如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時取出濾紙,放入105 ℃的干燥箱中干燥5 min[4].
圖2 層析示意圖Fig.2 Diagrammatic sketch of chromatography
1.2.2 茚三酮法定量檢測絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開缸中靜置20 min,使缸內(nèi)環(huán)境達到平衡,在距濾紙下端2 cm處劃一橫線,用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液點樣于橫線
上,待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開缸中,如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時取出濾紙,放入干燥箱中,在105 ℃條件下干燥5 min.干燥后的濾紙上會呈現(xiàn)明顯的氨基酸顯色斑點,剪下氨基酸顯色斑點,將其放置于帶塞玻璃試管中(比色管),用4 mL洗脫液洗脫35 min,再倒入比色皿中靜置24 h(確保液體中的紙末全部沉淀),以洗脫液為對照樣,在722E分光光度計上(波長570 nm處)測定吸光度[5-6].
2.1.1 溶液pH的影響 用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將層析液分別配制成pH為1.03、2.02、2.50、3.05、4.50的溶液,用微量進樣器取5 μL絲氨酸標準溶液點樣,進行層析顯色.
由于層析液在堿性條件下分層,所以用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將1 g/L絲氨酸標準溶液分別配制成pH為6.56、8.77、9.50、11.05、12.05,取5 μL點樣,將層析液配制成弱堿性溶液,進行層析顯色[7].
實驗結(jié)果歸納于表1.
表1 pH對顯色反應(yīng)的影響Table 1 pH on the colour reaction
注: 1 g/L絲氨酸標準溶液5 μL;105 ℃下烘干5 min;每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液
由表1可知,當溶液pH低至2.0時不顯色,從pH為2.5開始有淡紫色出現(xiàn),但pH超過9.5時淡紅色不是很明顯,之后不再顯色,可知顯色范圍在2.50~9.50之間,α-氨基酸[1]和茚三酮的顯色反應(yīng)對介質(zhì)的pH值非常敏感.
學(xué)者研究表明:α-氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)中,主要的顏色產(chǎn)物均通過縮合形成.與羰基化合物和氨的衍生物之間的反應(yīng)類似,在弱酸性條件下,這種縮合反應(yīng)更容易發(fā)生[5,8],酸性條件還能減少氨基以外的其它基團對顯色反應(yīng)的干擾,使顯色反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物更穩(wěn)定.強酸性介質(zhì)中雖然能增強茚三酮或1,3-茚三酮羥基的反應(yīng)能力,但在強酸性條件下卻降低了參與縮合反應(yīng)的氨基、羥基等新核基團的活性,使有色的縮合產(chǎn)物形成困難而且縮合生成的顏色產(chǎn)物在強酸性介質(zhì)中也不穩(wěn)定.在堿性條件下,顯色反應(yīng)需加熱才能完成,而且在離熱后,空氣中的氧分子或其他氧化物容易與還原型的有色縮合產(chǎn)物發(fā)生氧化還原反應(yīng),引起顏色變化甚至褪色.又因在堿性介質(zhì)中,很多基團或化合物的還原能力得到加強,擴大了茚三酮的顯色反應(yīng)范圍,使得副反應(yīng)增多,從而使反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物及產(chǎn)物顏色變得復(fù)雜化,在分子內(nèi)部因素和外來因素的雙重影響和干擾下,不利于茚三酮對α-氨基酸的檢驗和測定,并且堿性介質(zhì)中顏色的不穩(wěn)定也妨礙了對α-氨基酸的準確分析[5].
綜上所述,α-氨基酸和茚三酮的顯色反應(yīng)宜在弱酸性下進行.因此,本實驗中選定層析液的pH為4.50左右.
2.1.2 顯色劑用量的影響 取8組20 mL配制好的展層劑,分別加入0.4、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2、6.0 mL 0.1%茚三酮溶液,作為層析液,調(diào)節(jié)層析液pH至4.50左右.用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液15 μL點樣于濾紙上,進行層析[9-10].按照實驗方法測定每個顯色體系的吸光度并繪制成圖,結(jié)果見圖3.
圖3 顯色劑用量對吸光度的影響Fig.3 Dosage of chromogenic agent on absorbance
由圖3可看出,吸光度開始時隨著顯色劑用量的增加而增大,然后趨于平衡.當顯色劑用量為2.2 mL時,吸光度上升到最大,之后再增加顯色劑用量,吸光度基本無明顯變化,因此顯色劑用量為2.2 mL時最佳.因此,本實驗中選擇每10 mL展層劑中加入2.5 mL顯色劑.
2.1.3 反應(yīng)溫度及時間的影響 反應(yīng)需在加熱狀態(tài)下進行,因此反應(yīng)溫度及時間對顯色效果也存在較大影響.取4組20 mL展層劑,分別加入5 mL顯色劑并調(diào)節(jié)pH至4.50左右.用微量進樣器取1 g/L絲氨酸標準溶液15 μL點樣于濾紙上,進行層析[7].分別放入105、90、75、60 ℃的溫度下顯色,結(jié)果見表2.
表2 反應(yīng)溫度及時間對顯色效果的影響Table 2 Reaction temperature and time on colour effects
注: 絲氨酸標準溶液為1 g/L;每10 mL展層劑中有2.5 mL顯色劑.
由表2可知,當溫度為60 ℃時,即使加熱13 min以上也只顯出淡紫色;溫度為75 ℃時,加熱7.5 min才出現(xiàn)顏色變化;溫度為90 ℃時,加熱6.5 min就有顏色變化;當溫度上升到105 ℃時,加熱3.7 min即出現(xiàn)明顯的顏色變化.綜合各方面的考慮,反應(yīng)的最佳條件應(yīng)選在105 ℃下加熱4~5 min.若加熱時間過長會導(dǎo)致顯色斑點顏色擴散,影響吸光度的測定.
2.2.1 標準曲線的繪制 取5組20 mL層析液,pH調(diào)至4.55,用微量進樣器分別取1 g/L絲氨酸標準溶液5、10、15、20、25 μL點樣于層析濾紙上,按實驗方法進行實驗,測定吸光度,以標準溶液的用量與吸光度做絲氨酸標準曲線[10],見圖4.
圖4 絲氨酸標準曲線Fig.4 Standard curve of serine
從圖4可知,絲氨酸用量與吸光度呈線性關(guān)系,其回歸線方程為y=0.001 7x-0.000 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8.
2.2.2 測定方法的精密度 精密度[11]一般用相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示.
取一定量的絲氨酸溶液,按照實驗方法,進行多次比色測定(n=5),計算絲氨酸含量,結(jié)果見表3.
表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Repetitive experimental results
注: pH為4.55;105 ℃下烘干5 min;每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.
由此可見,此測定方法的重復(fù)性較好,精密度較高,比較可靠.
茚三酮比色法定量檢測絲氨酸操作簡單、成本低.只要控制好實驗條件,就能取得較好的測量結(jié)果.本文探討了溶液pH、顯色劑用量、反應(yīng)溫度及時間對茚三酮比色法定量檢測絲氨酸的影響,測定了絲氨酸標準曲線并得到了最佳實驗條件:溶液pH為4.50,顯色劑用量為每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮顯色劑,在105 ℃下加熱5 min.
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