陳靚靚，羅為桂，劉 清，蘇 益

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

植物 HKT（high-affinity K+transporter）是一類(lèi)Na+（或K+）轉(zhuǎn)運(yùn)體或Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)體的總稱，與植物Na+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及耐鹽關(guān)系密切[1-3]。HKT與微生物的Trk/Ktr同源，它們共同組成了Trk/Ktr/HKT基因家族[4-5]。TaHKT1首先從小麥（Triticum aestivum L.）中分離[6]，隨后在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中也發(fā)現(xiàn)了 HKT基因[7-8]。HKT由多個(gè)跨膜區(qū)和多個(gè)孔環(huán)（pore loop，P-loop）組成，基本結(jié)構(gòu)單元是MPM（Transmembrane segment,Pore,Transmembrane segment），植物HKT通常含有4個(gè)MPM結(jié)構(gòu)。第1個(gè)P-loop中關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)Gly/Ser影響離子滲透性[9]。HKT家族成員數(shù)量巨大，功能較復(fù)雜，到目前為止，對(duì)高等植物HKT的研究主要集中在擬南芥、水稻和小麥等少數(shù)物種中且涉及的成員較少，還未見(jiàn)研究玉米（Zeamay L.）HKT的相關(guān)報(bào)道。該研究利用各種生物信息學(xué)分析工具，將1個(gè)玉米中功能還未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）初步命名為ZmHKT1；5，并分析其蛋白氨基酸序列，推測(cè)ZmHKT1；5蛋白的進(jìn)化位置、理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)，旨在為進(jìn)一步試驗(yàn)研究ZmHKT1；5轉(zhuǎn)運(yùn)體在玉米中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以GenBank中檢索到的1個(gè)玉米中功能還未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）為檢索序列，使用Blastp程序檢索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選獲得同源HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體。

1.2 方法

1.2.1 分子進(jìn)化分析 采用ClustalX1.83[10-11]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，將ClustalX比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入PHYLIP3.69軟件包，用bootstrap程序生成隨機(jī)樣本，隨機(jī)樣本導(dǎo)入prodist程序計(jì)算距離矩陣，neighbor程序?qū)⒕嚯x矩陣轉(zhuǎn)換為N-J多重樹(shù)，使用consense程序匯總所得多重樹(shù)得到嚴(yán)格一致樹(shù)，最后將進(jìn)化樹(shù)文件導(dǎo)入MEGA5.05繪制進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 蛋白質(zhì)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析 采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；以BioEdit7.01程序中Hphob./Kyte&Doolittle標(biāo)度進(jìn)行疏水性分析；以SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；以SOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)；以 PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；以Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmHKT1；5分子進(jìn)化分析

2.1.1 多重序列比對(duì) 根據(jù)第1個(gè)P-loop過(guò)濾器（filter）上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的不同可將植物HKTs分成兩個(gè)亞家族[4]。亞類(lèi)I：第1個(gè)P-Loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為絲氨酸，通常情況下這類(lèi)HKT對(duì)Na+具有特異選擇性，所有單子葉和雙子葉植物中都含有該類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體[2，12]。亞類(lèi)II：第1個(gè)P-loop中關(guān)鍵位點(diǎn)為甘氨酸，這類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體具有K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)特性[8-9]，該亞家族成員只出現(xiàn)在單子葉植物中，但是水稻OsHKT2；1依然為絲氨酸特性[13]。已有研究表明，HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)體在植物耐鹽和調(diào)節(jié)體內(nèi)的Na+/K+平衡中發(fā)揮了重要作用[14-15]。利用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，截取HKT類(lèi)蛋白的4個(gè)P-loop區(qū)中高度保守的特征性的氨基酸位點(diǎn)多為甘氨酸（G），ZmHKT1；5蛋白第 1個(gè) P-loop中含有絲氨酸，屬于亞家族I。

2.1.2 蛋白質(zhì)分子進(jìn)化分析 進(jìn)化樹(shù)分析及聚類(lèi)結(jié)果如圖1所示，在HKT蛋白家族中與ZmHKT1；5 關(guān)系較近的轉(zhuǎn)運(yùn)體有 OsHKT1；5、HvHKT1；5、TaHKT1；5等，預(yù)示著在功能上ZmHKT1；5蛋白可能與這些蛋白最為接近，因此將該HKT歸為亞家族I并命名為ZmHKT1；5是合理的。

2.2 ZmHKT1；5性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)

圖1 ZmHKT1;5蛋白及其同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.2.1 理化性質(zhì) ZmHKT1；5蛋白由467個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為50.88 kD，等電點(diǎn)為9.06。含量較高的氨基酸殘基是Leu（58個(gè)）、Ser（47個(gè)）、Val（44個(gè)）、Ala（39個(gè)）、Gly（35個(gè)），酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為30，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為38。蛋白分子中含有9個(gè)半胱氨酸，假設(shè)全部形成二硫鍵時(shí)，280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 50 920 L/(mol·cm)，0.1% 濃度（1 g/L）的吸光值為1.001。假設(shè)蛋白分子中形成的二硫鍵全部打開(kāi)，280 nm處的摩爾消光系數(shù)為50 420 L/(mol·cm)，0.1%濃度（1g/L）的吸光值為0.991。成熟蛋白質(zhì)在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為40.73，高于閾值40，性質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)為98.31，總平均親水性為0.331，疏水性較強(qiáng)。

2.2.2 疏水性分析 根據(jù)BioEdit分析結(jié)果可知，整個(gè)ZmHKT1；5蛋白中疏水性最大值約為3.09，最小值約為-2.89，疏水性強(qiáng)的區(qū)域按疏水程度從大到小依次為：360～380、250～265、300～325、390～405、45～65、175～200、145～160、125～135、20～35、280～290、440～450、225～235，這些區(qū)域可能是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 ZmHKT1；5蛋白疏水性分析

2.2.3 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 使用在線信號(hào)肽預(yù)測(cè)程序SignalP4.0預(yù)測(cè)ZmHKT1；5蛋白N端序列，由圖3可知，各值均未超過(guò)閾值，ZmHKT1；5不具信號(hào)肽。

圖3 ZmHKT1；5信號(hào)肽分析

2.2.4 跨膜區(qū)域預(yù)測(cè) 使用在線工具SOSUI分析ZmHKT1；5的膜結(jié)構(gòu)，由表1可知ZmHKT1；5為典型膜蛋白，具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。ZmHKT1；5可能的跨膜結(jié)構(gòu)模型如圖4所示。

圖4 ZmHKT1;5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型

2.2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) PredictProtein的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZmHKT1；5含有58.67% α 螺旋（H）、7.07% β折疊（E）和34.26%無(wú)規(guī)卷曲（L）。

2.2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Phyre2檢索分析ZmHKT1;5序列，以折疊識(shí)別法進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。Phyre2在 PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到編號(hào)為c3pjzA的模板（副溶血性弧菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體TrkH的晶體結(jié)構(gòu)）與目標(biāo)蛋白有很好的同源性，能以100%的信度為目標(biāo)蛋白80%的序列構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖5所示，ZmHKT1；5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)氨基酸順序著色，順著蛋白N端到C端著色由淺變深，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果比照，結(jié)果較為統(tǒng)一，所得三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)較為可信。

圖5 ZmHKT1；5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

通過(guò)生物信息學(xué)手段分析了玉米中新型HKT家族蛋白ZmHKT1；5的蛋白序列，確定了該蛋白分類(lèi)和進(jìn)化位置。ZmHKT1；5具有在氨基酸序列上絲氨酸特性，可能是1個(gè)Na+選擇型的轉(zhuǎn)運(yùn)體。從該各項(xiàng)理化性質(zhì)看，ZmHKT1；5具有較強(qiáng)的疏水性。從二級(jí)結(jié)構(gòu)上，ZmHKT1；5含大量α螺旋，也含有較多的無(wú)規(guī)卷曲，β折疊的含量較少，這種組成與該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的形成密切相關(guān)，為該蛋白的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的實(shí)現(xiàn)提供基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ZmHKT1；5為典型的膜蛋白，具有8個(gè)跨膜螺旋，形成4個(gè)MPM結(jié)構(gòu)，各個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的具體生理功能還有待進(jìn)一步探索。已有研究表明，與ZmHKT1；5親緣關(guān)系很近的OsHKT1；5和TaHKT1；5為Na+選擇型轉(zhuǎn)運(yùn)體，能從根木質(zhì)部卸載Na+，通過(guò)控制根木質(zhì)部Na+的移動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)水稻中K+/Na+的比率，維持根中高的K+濃度和低的Na+，在植物耐鹽中起了重要作用[16]。另外，根據(jù)ZmHKT1；5的三維構(gòu)象及其與其他HKT類(lèi)蛋白高度的同源性可以推測(cè)，ZmHKT1；5蛋白可能在玉米的Na+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控Na+/K+平衡等方面具有重要作用，其生理功能及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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