葉良濤，錢家忠，左勝鵬，李蜀萍，陳雅瓊

（1.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 蕪湖241003；2.合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥230009）

一些水生植物能產(chǎn)生化感物質(zhì)抑制有害藻類的生長(zhǎng)，因此利用水生植物的化感潛力抑藻成為一種很有前景的藻類控制技術(shù)［1，2］。如挺水植物中的蘆葦（Phragmitescommunis）釋放2－甲基乙酰乙酸乙酯［3］、浮水植物中的鳳眼蓮（Eichhorniacrassipes）釋放 N－苯基－2－萘胺［4］、沉水植物中的穗花狐尾藻（Myriophyllumspicatum）［5］產(chǎn)生五倍子酸、焦棓酸等，均能抑制水體中有害藻類的生長(zhǎng)。兩棲植物喜旱蓮子草（Alternantheraphiloxeroides）是莧科多年生草本植物，原產(chǎn)南美洲，后被引入北美洲、大洋洲、東南亞和中國(guó)等地，現(xiàn)已成為一個(gè)世界性的入侵植物種［6］。目前關(guān)于喜旱蓮子草的研究多集中于喜旱蓮子草生物入侵性［7］、生態(tài)適應(yīng)性［8］、生物防治［9］、環(huán)境效應(yīng)［10］以及對(duì)草坪草的化感作用［11］等方面的內(nèi)容，而關(guān)于入侵植物喜旱蓮子草抗藻方面的研究鮮有報(bào)道。由于在我國(guó)巢湖、滇池、太湖等眾多淺型湖泊中幾乎連年暴發(fā)水華，有害藻中以藍(lán)藻和綠藻居多。因此，本研究選擇銅綠微囊藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)不同的喜旱蓮子草水體營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，比較分析了喜旱蓮子草活體和殘?bào)w植株對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，同時(shí)調(diào)查水體理化性質(zhì)，試圖揭示富營(yíng)養(yǎng)化水體中入侵植物喜旱蓮子草化感控藻的機(jī)制，為有效地管理和利用入侵植物，以及合理控制水華提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

銅綠微囊藻購自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。實(shí)驗(yàn)前用BG11培養(yǎng)基在GHP－160光照培養(yǎng)箱（三發(fā)，上海）中對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行擴(kuò)大并穩(wěn)定繼代培養(yǎng)，光暗周期12h∶12h，晝間溫度25℃，光強(qiáng)70μmol／（m2·s）；夜間溫度20℃。喜旱蓮子草于2009年7月采自于巢湖忠廟濕地，實(shí)驗(yàn)前分別經(jīng)自來水、蒸餾水各沖洗3次，每次10min，去除植株上攜帶泥沙、附著物等雜質(zhì)。其中一部分植株在水族箱作為活體培養(yǎng)，備用；另一部分在110℃下殺青15min，再自然晾干，剪成5cm小段，放于低溫冰箱保存，備用。

1.2 喜旱蓮子草活體和殘?bào)w植株化感抗藻測(cè)定

實(shí)驗(yàn)共設(shè)3種培養(yǎng)環(huán)境：富營(yíng)養(yǎng)化湖水（巢湖西半湖湖心，其水體特征見表1）、標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)液和二次蒸餾水。選取30株形態(tài)相似（30cm／株）、生物量相近、幼嫩鮮活的喜旱蓮子草植株，分別移植于裝有上述3種培養(yǎng)液（培養(yǎng)液體積為10L）的水族箱中（20cm×40cm×60cm），每箱移栽10株。當(dāng)移植成活后，分別在第0，5，10，15和20天用酸度計(jì)（雷磁，上海）測(cè)定培養(yǎng)水體的pH值和氧化還原電位。同時(shí)分別取2類材料在3種不同水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下所對(duì)應(yīng)天數(shù)的種植水和腐解液100mL，先用定性濾紙過濾，再用0.45μm的濾膜（新亞，上海）進(jìn)行抽濾，最后通過0.22μm的濾膜（新亞，上海）濾除微生物和雜質(zhì)，儲(chǔ)藏于4℃冰箱備用。

表1 來自巢湖的富營(yíng)養(yǎng)化培養(yǎng)水體特征Table 1 Water features of eutrophic culture medium from Chaohu Lake mg／L

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在接種銅綠微囊藻的同時(shí)，分別加1，2，5，10，20mL上述3種濾液，培養(yǎng)3，6，9，12，15d后，發(fā)現(xiàn)10mL添加液對(duì)處于遲滯期（即0～6d）的銅綠微囊藻有顯著抑制，而且處理間差異顯著（P＜0.01，20mL為100%抑制，數(shù)據(jù)未顯示）。在已裝有50mL滅菌BG11培養(yǎng)液的錐形瓶中，于DL－CJ－2ND醫(yī)用型超凈工作臺(tái)上，分別接種5mL銅綠微囊藻液。

因此，本實(shí)驗(yàn)先采用喜旱蓮子草活體植株、3類水體（蒸餾水、BG11、富營(yíng)養(yǎng)水）、每類水體各取5個(gè)培養(yǎng)時(shí)期水樣（第0，5，10，15和20天），每時(shí)期均取20mL水樣，最后得到10mL濾液，加入到已接種4d的藻類培養(yǎng)液中，用帶微生物過濾的封口膜包裹好，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后，從各處理的錐形瓶中取10mL于試管中用低頻漩渦混合振蕩器振蕩2min，使藻細(xì)胞分布均勻，然后分別在顯微鏡（歐依卡，重慶）下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)定藻密度。培養(yǎng)過程中，每天定時(shí)振搖4次，進(jìn)行藻類擾動(dòng)，增強(qiáng)活力和保持正常增殖?；铙w植株共15個(gè)處理，每處理重復(fù)6次。同理，進(jìn)行殘?bào)w植株腐解實(shí)驗(yàn)，以上步驟基本相同，只是在以上3種培養(yǎng)液中，以50 g／L的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行添加喜旱蓮子草殘?bào)w植株，在水族箱自然腐解，最后測(cè)定藻密度。

化感指數(shù)（allelopathic index）的確立是根據(jù) Williamson和Richardson［12］提出的化感作用評(píng)價(jià)方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)水體對(duì)喜旱蓮子草化感抗藻的影響

在3種不同的水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下，喜旱蓮子草活體植株對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)為：蒸餾水＞富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液（圖1A）。喜旱蓮子草第5天的種植水已達(dá)到抗藻的一個(gè)高峰，隨后的第10天到第20天的種植水抑藻效應(yīng)趨于穩(wěn)定，但有輕微波動(dòng)。在蒸餾水培養(yǎng)下，其第5天種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感指數(shù)為70.7%，為最高值；之后從第5天到第15天的種植水化感指數(shù)持續(xù)下降，到第15天降到最低值；隨后其種植水化感指數(shù)又開始緩慢上升。在富營(yíng)養(yǎng)湖水培養(yǎng)下，喜旱蓮子草活體植株第5天種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感指數(shù)為56.5%；在第5～10天，其種植水化感指數(shù)開始緩慢上升，第10天達(dá)到最高（63.2%）；之后化感指數(shù)開始緩慢下降，第20天下降到最低值，僅為54%。在BG11營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)下，喜旱蓮子草活體植株第5天種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感指數(shù)為48.5%，達(dá)到最高值；隨后第5～20天，化感指數(shù)先下降再上升，然后再下降，直到最低值37.1%。喜旱蓮子草殘?bào)w植株腐解液化感抗藻動(dòng)態(tài)在3種不同營(yíng)養(yǎng)水體中差異顯著，表現(xiàn)為：富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液＞蒸餾水，但總體趨勢(shì)基本相同（圖1B），即第5天的腐解液化感指數(shù)達(dá)到最大值，隨后的第10～20天抑藻效應(yīng)趨于穩(wěn)定。在富營(yíng)養(yǎng)化湖水中腐解的喜旱蓮子草殘?bào)w植株表現(xiàn)出最佳的化感抑藻效應(yīng)，其第5天的腐解液就對(duì)銅綠微囊藻的化感指數(shù)達(dá)到91.7%；之后在第5～15天，其化感指數(shù)逐漸上升，并達(dá)到最高值（96%）；隨后，在第15～20天，其值略有下降。在BG11營(yíng)養(yǎng)液中腐解的喜旱蓮子草殘?bào)w植株抑藻效應(yīng)中等，其第5天的腐解液對(duì)銅綠微囊藻化感指數(shù)達(dá)到87.1%，僅次于第10天的腐解液對(duì)銅綠微囊藻87.9%的最高化感指數(shù)；之后在第10～20天，其化感指數(shù)持續(xù)下降。在蒸餾水中腐解的喜旱蓮子草殘?bào)w植株化感抑藻效應(yīng)在3類模擬水體環(huán)境中最低，其腐解液對(duì)銅綠微囊藻的化感指數(shù)最高值僅為78.5%。

2.2 喜旱蓮子草培養(yǎng)水體的pH變化

喜旱蓮子草的活體植株和殘?bào)w植株的水培養(yǎng)液pH值隨時(shí)間推移而發(fā)生改變，殘?bào)w植株腐解液的pH值主要呈酸性，而活體植株培養(yǎng)液的pH值變化趨勢(shì)不一致（圖2）?；铙w植株的富營(yíng)養(yǎng)化湖水培養(yǎng)液pH值偏堿性，在標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)液中pH值近似為中性，在蒸餾水培養(yǎng)液中pH值偏酸性，即3類水體的pH值按降序排列為：富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液＞蒸餾水（圖2A）。在不同的水體環(huán)境中喜旱蓮子草殘?bào)w植株腐解液的pH值變化趨勢(shì)很明顯，都是隨時(shí)間的推移緩緩下降，但到了15d以后pH變化趨勢(shì)平穩(wěn)，基本無變化（圖2B）。喜旱蓮子草殘?bào)w植株可能在腐解的過程中釋放某些酸性物質(zhì)，使得pH緩緩下降。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)水體中的喜旱蓮子草活體植株（A）和殘?bào)w植株（B）對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of living plants（A）and dead plants（B）of A.philoxeroides on the growth of M.aeruginosain different trophic status

圖2 喜旱蓮子草的培養(yǎng)液在不同培養(yǎng)時(shí)間下的pH變化Fig.2 pH variation of cultivated solution of A.philoxeroides at different cultivated period A：活體植株 Living plants；B：殘?bào)w植株 Dead plants.

2.3 喜旱蓮子草培養(yǎng)水體氧化還原電位變化

喜旱蓮子草的活體植株培養(yǎng)液和殘?bào)w植株腐解液的氧化還原電位隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，且兩者氧化還原電位變化趨勢(shì)不同（圖3）。喜旱蓮子草活體植株蒸餾水培養(yǎng)液的氧化還原電位的總變化趨勢(shì)是先逐漸下降到最低點(diǎn)再逐漸上升。喜旱蓮子草活體植株富營(yíng)養(yǎng)化湖水培養(yǎng)液的氧化還原電位總變化趨勢(shì)是先緩慢上升后逐漸下降。喜旱蓮子草活體植株標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)液的氧化還原電位也是先緩慢上升，但后期大幅下降。喜旱蓮子草殘?bào)w植株的3類水體環(huán)境腐解液的氧化還原電位變化趨勢(shì)基本一致，都是逐漸下降的，按降序來排列大致順序?yàn)椋赫麴s水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液＞富營(yíng)養(yǎng)化湖水?？傊?，活體植株培養(yǎng)液的氧化還原電位變化較緩，按降序來排列大致順序?yàn)椋赫麴s水＞富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液，其氧化還原電位值大部分比殘?bào)w植株腐解液氧化還原電位值高；殘?bào)w植株腐解液的氧化還原電位值變化幅度較大，且氧化還原電位值隨時(shí)間推移逐漸降低（圖3）。

圖3 喜旱蓮子草的培養(yǎng)液在不同培養(yǎng)時(shí)間下的氧化還原電位的變化Fig.3 Oxidation and reduction potential variation of cultivated solution of A.philoxeroides at different cultivated period A：活體植株 Living plants；B：殘?bào)w植株 Dead plants.

3 討論

3.1 喜旱蓮子草對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)特性的影響

植物化感物質(zhì)的釋放途徑主要包括植物揮發(fā)、根系分泌、雨霧淋溶、殘株分解等［13，14］。因此推測(cè)喜旱蓮子草活體植株主要通過根系分泌方式釋放化感物質(zhì)，而殘?bào)w植株主要采用腐解方式釋放化感物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)入侵植物喜旱蓮子草的活體植株和殘?bào)w植株培養(yǎng)液均對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)和繁殖表現(xiàn)出一定的化感抑制效應(yīng)，且喜旱蓮子草的殘?bào)w植株腐解液比活體植株種植水對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更強(qiáng)。喜旱蓮子草活體植株在不同水體培養(yǎng)環(huán)境下化感作用強(qiáng)弱關(guān)系，按降序排列為：蒸餾水＞富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液?？状谷A等［15］認(rèn)為在缺水、缺肥等環(huán)境脅迫條件下，植物可以通過釋放化感物質(zhì)的方式抑制周圍其他植物的生長(zhǎng)，從而增加其對(duì)養(yǎng)分、水分等的相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)能力。蒸餾水中培養(yǎng)的活體植株正是在缺肥的環(huán)境脅迫下，釋放大量化感物質(zhì)抑制周圍其他植物生長(zhǎng)，其種植水對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制效應(yīng)最強(qiáng)；同樣，在富營(yíng)養(yǎng)化湖水中培養(yǎng)的活體植株由于其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過剩，也會(huì)釋放大量化感物質(zhì)，但對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)比蒸餾水培養(yǎng)液要弱；而在營(yíng)養(yǎng)成分適中的BG11培養(yǎng)液生長(zhǎng)的喜旱蓮子草由于不受任何環(huán)境因子脅迫，釋放的化感物質(zhì)量最少，其化感指數(shù)也最低。研究還發(fā)現(xiàn)喜旱蓮子草殘?bào)w植株在不同水體培養(yǎng)環(huán)境下所呈現(xiàn)的化感作用也存在明顯的強(qiáng)弱關(guān)系，其順序?yàn)椋焊粻I(yíng)養(yǎng)化湖水＞標(biāo)準(zhǔn)BG11營(yíng)養(yǎng)液＞蒸餾水。而3種不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的水體環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分排列順序也為：富營(yíng)養(yǎng)化湖水＞BG11培養(yǎng)液＞蒸餾水。這表明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中某些成分可能會(huì)加快殘?bào)w植株分解的速度和程度，所以在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量越高的情況下，殘株越容易腐解釋放大量化感物質(zhì)，抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)和繁殖。

3.2 培養(yǎng)水體性質(zhì)pH和氧化還原電位對(duì)化感抗藻的影響

pH值是藻類生長(zhǎng)的非常重要的理化指標(biāo)。一般認(rèn)為，藍(lán)藻偏好較高的pH［16］，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在酸性pH和堿性pH條件下的活體植株培養(yǎng)液和殘?bào)w植株腐解液均對(duì)銅綠微囊藻有很好的抑制效應(yīng)，只是在低pH環(huán)境條件下，殘株腐解液的抑藻效應(yīng)表現(xiàn)得更強(qiáng)烈些。本研究中的喜旱蓮子草殘?bào)w植株腐解液比活體植株培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更強(qiáng)，殘?bào)w植株可能分解產(chǎn)生更多的酸性化感物質(zhì)，pH值開始下降，導(dǎo)致藻的生長(zhǎng)受到抑制，而后pH值又慢慢趨于穩(wěn)定，抑藻效應(yīng)也隨之趨于穩(wěn)定。目前還未見氧化還原電位變化與水生植物化感物質(zhì)釋放強(qiáng)度關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究中喜旱蓮子草活體植株培養(yǎng)液氧化還原電位變化較緩，而殘?bào)w植株腐解液的氧化還原電位表現(xiàn)為持續(xù)下降，這可能是活體植株培養(yǎng)液釋放化感物質(zhì)速率較慢，量較少，而殘?bào)w植株腐解液釋放化感物質(zhì)較快，量較多。喜旱蓮子草的殘?bào)w植株可能釋放一些具有還原性化學(xué)物質(zhì)，消耗了水中氧化性物質(zhì)，所以導(dǎo)致出現(xiàn)培養(yǎng)液中氧化還原電位緩緩下降現(xiàn)象，這些物質(zhì)具體化學(xué)成分還需進(jìn)一步分析。

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