胡海濤，匡 潔，張維林，楊 玲

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

植物響應(yīng)逆境及發(fā)育信號(hào)合成一類低分子量（15～30 kD）的熱激蛋白，簡(jiǎn)稱小熱激蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）[1]。植 物 含 有 豐 富 的sHSPs，普遍存在于各種組織中[2-3]，其中一些具有明顯的組織和發(fā)育特異性[3-5]。除高溫外，sHSPs還能被低溫、高鹽、干旱、重金屬離子、機(jī)械損傷、厭氧、病原物等多種脅迫誘導(dǎo)，亦能受胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)、花粉發(fā)育、果實(shí)成熟等植物正常發(fā)育過(guò)程調(diào)控[6-7]。復(fù)雜的表達(dá)模式與其所承擔(dān)的多樣生物學(xué)功能密切相關(guān)[8]。

1 植物sHSPs的種類和結(jié)構(gòu)特征

高分子量HSPs氨基酸序列在生物界高度保守，而植物sHSPs的氨基酸序列則高變[3]。根據(jù)氨基酸序列、免疫交聯(lián)反應(yīng)和在細(xì)胞中的定位，至少可將植物sHSPs分為6個(gè)亞類：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的胞漿Ⅰ類（-CⅠ）、胞漿Ⅱ類（-CⅡ）等，定位于細(xì)胞器的葉綠體類（-CP）、線粒體類（-MT）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類（-ER）和過(guò)氧化物酶體類（-Px）[2，4，9]。除了果蠅的sHSP22-ER外，4個(gè)細(xì)胞器特異性的亞類為植物所特有[10]。不同物種相同細(xì)胞器sHSPs之間的同源性比同一物種不同細(xì)胞器之間的同源性高[2]。

sHSPs具有如下保守特征：首先,所有的sHSPs初級(jí)結(jié)構(gòu)包含一個(gè)由約90個(gè)氨基酸組成的稱之為α-晶狀體蛋白域（α-crystallin domain，ACD）的核心域，即圖1中的β2～β9鏈，兩側(cè)各有一段N-末端和C-末端的可變延伸序列[5]；不同亞類sHSPs的N-端差異很大，但都含有靶向肽[5，9]。其次，ACD由保守區(qū)CRⅠ和CRⅡ組成（圖1b），CRⅠ和CRⅡ的β折疊在空間形成緊密的三文治結(jié)構(gòu)（圖1a）[10]。第三，大多在自然狀態(tài)下以8～32個(gè)單體組成200～800 kD的寡聚復(fù)合體起作用，高等植物寡聚復(fù)合體通常有12個(gè)單體[3，11-13]。盡管這些sHSPs的氨基酸序列相似性不高，但二級(jí)結(jié)構(gòu)卻保守[3]。一單體凸起的β6-loop與另一單體的β2鏈形成β折疊，組成具有活性的二聚體（圖1a），二聚體又是組裝寡聚復(fù)合體的結(jié)構(gòu)單元[10]。sHSPs的N-端對(duì)寡聚體的解體和單體的交換至關(guān)重要。

圖1 典型sHSPs的結(jié)構(gòu)組成[10]

2 植物sHSPs的分子伴侶功能

sHSPs同其他高分子量的HSPs一樣，具有分子伴侶功能，但其本身并不能直接重新折疊熱誘導(dǎo)的非折疊變性蛋白，而是具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，可與同等重量的變性底物結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，從而防止不可逆的非特異性聚集[14]。如圖2所示，自然狀態(tài)的目標(biāo)蛋白（N）在熱激下變?yōu)椴环€(wěn)定構(gòu)型蛋白（U），sHSPs通過(guò)與U的結(jié)合，避免蛋白質(zhì)的凝聚。sHSPs的寡聚復(fù)合體在熱激溫度下解離成小的、有活性的二聚體，與U結(jié)合形成大的分子伴侶-底物復(fù)合物，在HSP100/HSP70的協(xié)作下，sHSPs結(jié)合的蛋白重新折疊恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)。在長(zhǎng)時(shí)間熱激條件下，植物sHSPs組成直徑約為40 nm中空的球型熱激粒，將細(xì)胞生存關(guān)鍵的某些蛋白或者RNA限制于球型粒的表面或者內(nèi)部加以保護(hù)；熱激粒還是sHSPs與HSP70共存之地，令兩類分子伴侶的合作更為有效[14]。一旦條件適宜，sHSPs便釋放所結(jié)合的蛋白，隨后借助依賴ATP的DnaK、ClpB/DnaK等伴侶蛋白系統(tǒng)進(jìn)行重新折疊（圖2）。也就是說(shuō)，sHSPs分子伴侶活性是不利用ATP能量而被動(dòng)地介導(dǎo)底物結(jié)合/釋放循環(huán)[14]，而大分子HSP70、HSP40等的功能則需要依賴于ATP[3]。

圖2 sHSPs的分子伴侶作用示意圖[14]

正常溫度下，sHSPs中那些可與底物蛋白結(jié)合的疏水基團(tuán)埋于寡聚復(fù)合體結(jié)構(gòu)內(nèi)部；高溫下，由于寡聚復(fù)合體解體為穩(wěn)定的二聚體和/或構(gòu)象發(fā)生變化，使得ACD的疏水表面及N-端臂上的疏水基團(tuán)外露，N-端連同ACD疏水表面的柔性能夠適應(yīng)結(jié)合多種具有不同疏水表面構(gòu)型的變性蛋白底物。變性底物與sHSPs結(jié)合面的親和性及兼容性，部分決定了保護(hù)底物的效率。sHSPs與底物的互作、保護(hù)底物的效率還取決于熱誘導(dǎo)sHSPs構(gòu)象變化與底物變性的相對(duì)動(dòng)力學(xué)、底物聚集以及與sHSPs結(jié)合間的競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)[15]。sHSPs與底物的互作非常復(fù)雜，不同種sHSPs的作用機(jī)制不同[12]，同一種sHSPs因底物蛋白的不同差異也很大[15]。CⅡ類sHSPs的十二聚合體比CⅠ類的熱穩(wěn)定性要高，在高溫下不會(huì)解體為穩(wěn)定的二聚體，而是通過(guò)構(gòu)象的變化有效地與變性蛋白結(jié)合[12]。從上面的模型可以看出，N-端至少部分決定sHSPs與不同底物的特異性結(jié)合[13]。胞漿類sHSPs的底物特異性很低，其多樣的N-端結(jié)構(gòu)使其可以與各種客戶蛋白結(jié)合。C-端借助保守基序[KR]X[IV]X[IV]參與同型寡聚反應(yīng)以及熱激粒的形成[14]。體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了植物sHSPs具有熱保護(hù)可溶性蛋白的能力[15-16]。

3 sHSPs與植物的生長(zhǎng)發(fā)育

在正常生長(zhǎng)條件下，有些sHSPs在所有的組織中組成型表達(dá)，不受熱激甚至任何脅迫誘導(dǎo)[2-6，8-9]，說(shuō)明它們并不是作為分子伴侶，而是作為特定的管家蛋白在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育中行使重要的功能[2，4]。擬南芥sHSP17.8-CⅠ在正常生長(zhǎng)溫度下表達(dá)，被認(rèn)為作為錨定重復(fù)蛋白2A（ankyrin repeat protein 2A，AKR2A）的輔助因子，使膜蛋白定位于葉綠體外膜。其具體的機(jī)制可能是：sHSP17.8-CⅠ在正常生理?xiàng)l件下以二聚體存在，即可以與葉綠體結(jié)合，又能夠通過(guò)識(shí)別錨定蛋白重復(fù)域(最常見(jiàn)的蛋白與蛋白互作域)與AKR2A結(jié)合，而AKR2A具有與葉綠體、過(guò)氧化物體結(jié)合的能力。sHSP17.8-CⅠ不能直接與葉綠體外膜蛋白結(jié)合，而是作為AKR2A的輔助因子同時(shí)結(jié)合葉綠體和AKR2A，從而指導(dǎo)AKR2A特異性地靶向葉綠體而非過(guò)氧化物體，完成輸送蛋白至葉綠體的任務(wù)[17]。番茄sHSP21-CP通過(guò)促進(jìn)類胡蘿卜素的積累，參與果實(shí)的發(fā)育[7]。

在正常生長(zhǎng)條件下，某些sHSPs在特定發(fā)育階段或者特定組織表達(dá)，表明其參與了特定的植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[18]，但其中的具體作用機(jī)理尚不清楚。

4 sHSPs與植物的抗逆性

葉綠體是非脅迫和脅迫條件下活性氧分子的發(fā)生地。sHSPs-CP特有的富蛋氨酸的雙親α-螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)可庇護(hù)氧化敏感蛋白，以及其響應(yīng)氧化脅迫所進(jìn)行的構(gòu)象變化能力使之具有消除氧化脅迫的優(yōu)勢(shì)[7]。番茄sHSP21-CP具有溫度依賴性的抗氧化作用，保護(hù)PSII免受活性氧的傷害，防止PSII組分的聚集，并保證組分的重新折疊[7]。耐熱巨序剪股穎在Ni和Pb脅迫下的凈光合作用與sHSPs-CP積累相關(guān)[19]。玉米sHSPs-CP在4種重金屬（Cu、Ni、Pb、Zn）脅迫下的積累水平與嚴(yán)重?zé)峒ふT導(dǎo)的量相當(dāng)，其純化物可以保護(hù)體外光合電子傳遞免受Pb的直接毒害[19]。將水稻sHSP26-CP轉(zhuǎn)至高牛毛草中，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在甲基紫精處理或熱脅迫后，電導(dǎo)滲漏率、脂過(guò)氧化均顯著低于野生型，而葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm卻較穩(wěn)定，說(shuō)明sHSP26-CP在氧化脅迫或熱脅迫下能夠保護(hù)膜，從而保護(hù)了PSII的功能[20]。

玉米sHSPs-MT在鹽脅迫下主要通過(guò)保護(hù)NADH:泛醌氧化還原酶復(fù)合體的活性，改善線粒體的電子傳遞[21]。將番茄sHSP23.8-MT基因?qū)霟煵?，高溫下超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草線粒體的氧化磷酸化效率高于對(duì)照[22]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是核糖體上合成的分泌蛋白的運(yùn)輸通道。增加sHSP-ER的量，可以有效降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白的錯(cuò)誤折疊和異常裝配。番茄sHSP21.5-ER起分子伴侶的作用，使基因超表達(dá)的大腸桿菌更耐熱[16]。

根結(jié)線蟲(chóng)侵染煙草后，誘導(dǎo)某些根細(xì)胞再分化轉(zhuǎn)化成特異的巨細(xì)胞，巨細(xì)胞內(nèi)的代謝速率非?？?，為線蟲(chóng)及植株提供養(yǎng)分，所以推測(cè)巨細(xì)胞中積累的內(nèi)源sHSPs行使分子伴侶的功能，以阻止大量合成蛋白的聚集[18]。煙草sHSP17的表達(dá)在接種無(wú)毒性青枯病菌株時(shí)要比接種毒性菌株高得多。sHSP17沉默株系的煙草葉片，接種無(wú)毒性青枯病菌株后，此細(xì)菌的增殖比對(duì)照組提高了10倍，而接種毒性青枯病菌株的增殖并不像前者那么快。sHSP17可能作為分子伴侶而非特異性的穩(wěn)定包括信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)蛋白，從而維持細(xì)胞內(nèi)適宜的環(huán)境以誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)[23]。柑橘sHSP15.5和菜椒sHSP16在與親和、非親和菌株互作早期均積累，說(shuō)明兩者參與植物的基礎(chǔ)性免疫反應(yīng)，sHSP15.5和sHSP16的作用就是維持新合成蛋白質(zhì)的未折疊構(gòu)象，直至被HSP60和HSP70復(fù)合物等伴侶分子正確折疊[24]。

大量的研究證實(shí)sHSPs具有交叉保護(hù)功能。sHSPs在細(xì)胞中除了不依賴ATP的穩(wěn)定構(gòu)象受到破壞的蛋白之外，還可與脂分子協(xié)同調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性[25]。熱脅迫下藍(lán)細(xì)菌PCC6803中的sHSP16.6-CP與類囊體膜脂相互作用后，膜脂的流動(dòng)性降低；而缺失sHSP16.6-CP基因的藍(lán)藻突變體較野生型的類囊體膜具有更高的流動(dòng)性，對(duì)熱更加敏感[26]，從而證實(shí)了sHSPs調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的功能。在極端溫度下，膜流動(dòng)性作為識(shí)別脅迫，并活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑已被建立。由于其他脅迫也能改變膜的流動(dòng)性或者造成各種膜的傷害，sHSPs與膜的相互作用可以解釋sHSPs對(duì)脅迫的交叉反應(yīng)。

5 展望

sHSPs具有獨(dú)特的生物學(xué)特性及功能，在植物體內(nèi)廣泛參與了各種復(fù)雜的功能活動(dòng)。在基因水平上，sHSPs可以與mRNA結(jié)合形成熱激粒，保護(hù)這些mRNA在熱激脅迫下不受傷害。在蛋白水平上，sHSPs于熱激及其恢復(fù)時(shí)期在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器之間穿梭，參與細(xì)胞內(nèi)新合成蛋白質(zhì)的折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性、降解，維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，起到保護(hù)細(xì)胞不受高溫傷害的分子伴侶作用[16，19，23]。近幾年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人工采用超表達(dá)的方式提高植物中sHSPs的表達(dá)以增強(qiáng)植物的抗逆性能力已經(jīng)成為一種較為成熟的技術(shù)手段[25]。

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