周松峰，廖文軍，覃紹敏，袁書(shū)智，白安斌，吳健敏

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RV）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性人畜共患傳染病。所有溫血?jiǎng)游锒伎筛腥荆袢∫坏┌l(fā)病，病死率幾乎100%［1］，是人類病死率最高的急性傳染病之一?？袢〔《綠基因編碼的糖蛋白（glycoprotein，GP）是病毒唯一暴露在表面的蛋白［2］，是唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的病毒蛋白［3］，在狂犬病毒致病和免疫中起著關(guān)鍵作用［4］。

狂犬病的診斷方法目前主要有中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等，但這些檢測(cè)方法對(duì)儀器和專業(yè)人員的依賴性較高，檢測(cè)成本昂貴，且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，極大的限制了它們?cè)诨鶎訂挝坏膽?yīng)用，由于我國(guó)面積遼闊，農(nóng)村散養(yǎng)犬較多，在開(kāi)展RV的監(jiān)測(cè)及免疫效果評(píng)估時(shí)，急需建立一種快速、敏感、穩(wěn)定，可以現(xiàn)場(chǎng)使用的檢測(cè)方法。

近年來(lái)自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)發(fā)展迅速［5］，已在多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用［6－7］。該方法的基本原理是：以紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，利用基因工程方法構(gòu)建一種重組雙功能融合蛋白（目標(biāo)抗原或抗體與紅細(xì)胞非凝集型抗體［8］聯(lián)結(jié)而形成的抗原－抗體或抗體-抗體結(jié)合物），該融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體/抗原結(jié)合，通過(guò)樣品中被檢抗體/抗原的橋聯(lián)作用，使指示紅細(xì)胞發(fā)生凝集，根據(jù)指示紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

本實(shí)驗(yàn)室利用該技術(shù)成功建立了檢測(cè)豬瘟、豬偽狂犬病毒的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)［9－10］。因此本試驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上利用（SOE）PCR技術(shù)，將狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū)kg與抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體2E8scFv［11］拼接成雙功能融合基因，進(jìn)行表達(dá)復(fù)性并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行檢驗(yàn)，構(gòu)建既能與人紅細(xì)胞結(jié)合，又能與RV抗體反應(yīng)的雙功能融合蛋白。目的是為了進(jìn)一步建立狂犬病毒抗體快速檢測(cè)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、載體、菌株和血清 重組質(zhì)粒pMD-G（含有狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū)）、鼠抗RV高免血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈(zèng)；重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv（含有抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因）［11］由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所章金剛研究員惠贈(zèng)；原核表達(dá)載體pET-TrX、表達(dá)菌株BL21（DE3）pLysS均由本實(shí)驗(yàn)室保存；7份RV陽(yáng)性血清、7份RV陰性血清、犬細(xì)小病毒（CPV）陽(yáng)性血清、犬瘟熱病毒（CDV）陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Kod-plus高保真酶為TOYOBO（日本）產(chǎn)品；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、及TaqDNA 聚合酶均購(gòu)自 TaKaRa（日本）公司；IPTG購(gòu)自Promega公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG為Beyotime產(chǎn)品；Ni-NTA蛋白純化樹(shù)脂為QIAGEN公司產(chǎn)品；氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽均為Sigma公司產(chǎn)品；其它化學(xué)試劑均為南寧（中國(guó)）生化藥品儀器公司分析純產(chǎn)品。

1.3 重組PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)重疊延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因與2E8scFv基因序列，設(shè)計(jì)4條重組PCR引物 （表1）。其中引物2E8scFv-U/2E8scFv-D用于擴(kuò)增合成2E8scFv基因，引物Kg－U/Kg-D用于擴(kuò)增合成Kg基因。2E8scFv3′末端15個(gè)堿基和Kg5′端15個(gè)堿基為互補(bǔ)序列（陰影部分）用于基因的拼接，拼接順序?yàn)?E8-Kg。2E8scFv-U 和 Kg-D中的下劃線部分為引入的BamH I、EcoR I酶切位點(diǎn)。

表1 2E8scFv、Kg基因引物序列Tab.1 Primers of 2E8scFv and Kg

1.4 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以2E8scFV-U/2E8scFV-D和 Kg-U/Kg-D為引物，從pMD-2E8scFv和pMD-G重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增融合基因2E8Kg的5′端片段2E8scFv和3′端片段Kg基因。PCR擴(kuò)增條件均為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。以純化后的2E8scFv和Kg基因?yàn)槟０?，采用（SOE）PCR方法拼接成2E8Kg融合基因。第一輪PCR反應(yīng)體系為：2E8scFv和 Kg基因各0.5μL、10× Buffer2.5 μL、5U/μL KOD-plus高保真酶0.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL、用滅菌雙蒸水加至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1 min，60℃退火1min，72℃延伸2min，7個(gè)循環(huán)。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入引物2E8scFv-U和 Kg-D各0.5μL，然后95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將上述PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序正確后將融合基因2E8kg亞克隆到原核表達(dá)載體pET-Trx中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-2E8kg。

1.5 2E8Kg融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將鑒定正確的pET-Trx-2E8Kg原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）pLysS中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證其是否表達(dá)，用Band-Scan軟件測(cè)定目的蛋白相對(duì)含量。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)菌液，用細(xì)菌洗滌液初步洗滌后，加入細(xì)裂解液作用30min后用細(xì)胞破碎儀菌破碎處理3遍，分別收集沉淀和上清，沉淀用包涵體洗滌液洗滌兩遍后，用包涵體溶解液溶解，將上述溶解液和上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，進(jìn)行可溶性分析。

1.6 2E8Kg融合蛋白的純化與復(fù)性 將誘導(dǎo)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按上述方法制備包涵體后，采用親和層析法和谷胱甘肽再氧化法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性，復(fù)性24h后，用透析液透析48h，每6h換液一次，透析袋內(nèi)的液體即為純化和復(fù)性后的蛋白。用PEG20000濃縮復(fù)性蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其濃度。

1.7 2E8kg融合蛋白的 Western-blot檢測(cè) 將純化后的2E8kg融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上，將膜用封閉液（5%的脫脂奶粉）4℃封閉過(guò)夜，用TBST洗滌，一抗加入鼠抗RV高免血清，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色液顯色，邊搖動(dòng)邊觀察，至條帶清晰后加入雙蒸水終止其反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.8 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)2E8kg融合蛋白的雙功能生物學(xué)活性 取7份RV陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)7份RV陰性血清作對(duì)照，取96孔血凝板，每孔中加入50μL，然后再向每個(gè)孔中依次加入10μL雙功能融合蛋白（1.2mg/mL）和20μL 2%O型人紅細(xì)胞，混勻后靜置30min觀察結(jié)果；分別取A、B、AB型人紅細(xì)胞，按同樣的方法操作，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv和pMD-G為模板，分別擴(kuò)增出兩條大小分別為732bp和999bp的目的片段，命名為2E8scFv和Kg（如圖1），與預(yù)期擴(kuò)增片段一致。以瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段2E8scFv和Kg為模板，通過(guò)（SOE）PCR拼接成2E8Kg融合基因，將其克隆到pMD18-T Simple載體上，鑒定正確后插入原核表達(dá)載體pET-Trx，通過(guò)PCR（如圖2）及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該片段與融合基因2E8Kg一致，大小為1 731bp且讀碼框正確。表明融合基因和原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 目的基因2E8scFv和Kg的PCR擴(kuò)增圖M：DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：Kg基因；2：2E8scFv基因Fig.1 PCR amplification of 2E8scFv and Kg genesM：DNA Marker 2000；1：Kg gene；2：2E8scFv gene

圖2 融合基因2E8Kg的SOE-PCR擴(kuò)增圖M.DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.2E8Kg融合基因Fig.2 Amplification of 2E8Kg fusion gene by SOE-PCRM：DNA Marker 2000；1：2E8Kg fusion gene

2.2 2E8Kg融合蛋白的表達(dá)、可溶性分析、復(fù)性及純化 取pET-Trx-2E8Kg陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)pET-Trx空載體轉(zhuǎn)化菌為對(duì)照，結(jié)果在37℃，IPTG 濃度為0.7mmol/L，誘導(dǎo)3h時(shí)獲得最大表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白總量23.5%左右。SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶的包涵體形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量約77.7kD（如圖3），與預(yù)期蛋白分子大小一致。利用親和層析法對(duì)變性溶解的目的蛋白進(jìn)行純化并用BandScan生物學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明目的蛋白洗脫后的純度提高到了98.9%（圖略）。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定復(fù)性濃縮后蛋白含量約為1.7mg/mL。

圖3 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳的結(jié)果M.低分子量蛋白marker；1.空載體對(duì)照；2.誘導(dǎo)后重組菌蛋白Fig.3 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by SDS-PAGEM：Protein MW marker；1：Negative control；2：Recombinant bacteria protein after induction

2.3 2E8Kg融合蛋白 Western-blot檢測(cè) 用RV高免血清對(duì)2E8Kg融合蛋白進(jìn)行 Western-blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約在77.7kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶，而同時(shí)用CPV和CDV陽(yáng)性血清對(duì)2E8Kg融合蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果無(wú)任何免疫印跡條帶出現(xiàn)（圖4），說(shuō)明2E8kg融合蛋白能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng)，具有良好的免疫反應(yīng)原性。

2.4 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)2E8Kg融合蛋白的生物學(xué)活性 用純化和復(fù)性后的2E8Kg融合蛋白、2%人“O”型紅細(xì)胞、7份RV陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，結(jié)果7份RV陽(yáng)性血清均可觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象（圖5），而7份RV陰性血清未觀察到凝集現(xiàn)象（圖6）。用血型定型試劑盒篩選出A、B和AB型人紅細(xì)胞與RV陽(yáng)性血清進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，結(jié)果也觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象（圖7）。用CPV，CDV陽(yáng)性血清分別與2E8Kg融合蛋白作用，結(jié)果未發(fā)生凝集（圖8）。上述結(jié)果說(shuō)明2E8Kg融合蛋白不但能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng)，而且能與人紅細(xì)胞結(jié)合（無(wú)血型限制），具有雙功能特性。

圖4 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blot鑒定M.低分子量蛋白 marker；a.空載體對(duì)照；b.誘導(dǎo)后pET-Trx-2E8Kg重組菌蛋白；c.CPV陽(yáng)性血清陰性對(duì)照；d.CDV陽(yáng)性血清陰性對(duì)照。Fig.4 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by Western-blotM：Protein MW marker；a：Negative control；b：Recombinant bacteria pET-Trx-2E8Kg protein after induction；c：Negative control of CPV positive serum；d：Negative control of CDV positive serum

圖5 狂犬病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.5 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and O type human red blood cells；

圖6 狂犬病毒陰性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.6 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV negative serum，and O type human red blood cells；

圖7 狂犬病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.7 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and human red blood cells；

圖8 犬不同病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.8 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，different virus－positive serum of dog，and O type human red blood cells.

3 討 論

狂犬病是人畜共患的自然疫源性傳染病，目前尚無(wú)有效的治療方法，疫苗免疫預(yù)防狂犬病的發(fā)生尤其重要［12］。我國(guó)狂犬病發(fā)病死亡人數(shù)位居重點(diǎn)傳染病死亡數(shù)和病死率榜首，易感動(dòng)物發(fā)病呈逐年上升的趨勢(shì)，要徹底根除狂犬病，首先就必須消滅動(dòng)物的狂犬病，特別是隱性帶毒動(dòng)物及野生動(dòng)物的狂犬病。針對(duì)狂犬病的現(xiàn)狀，如何利用有效的診斷方法對(duì)隱性帶毒動(dòng)物快速診斷，對(duì)狂犬病疫苗免疫后的動(dòng)物進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)及免疫效果評(píng)估，是保證人和動(dòng)物安全的當(dāng)務(wù)之急。

目前，狂犬病現(xiàn)有的診斷方法對(duì)儀器和專業(yè)人員的要求較高，檢測(cè)成本昂貴，且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，因而極大的限制了它們?cè)诨鶎訂挝坏氖褂谩亩鴮?dǎo)致動(dòng)物狂犬病免疫效果評(píng)估的工作開(kāi)展較為困難，這對(duì)控制和消滅動(dòng)物狂犬病十分不利。自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)以其快速、簡(jiǎn)便、不需要任何儀器，僅憑肉眼就可以觀察結(jié)果的特點(diǎn)在人類疾病快速診斷中得到了較好的應(yīng)用。由于犬紅細(xì)胞表面抗原十分復(fù)雜，要尋找到各類血型的共有抗原十分困難，為此，本研究借助表面抗原背景清楚的人紅細(xì)胞作為指示劑建立檢測(cè)動(dòng)物病原抗體的紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)方法。

由于本實(shí)驗(yàn)拼接的融合基因長(zhǎng)度較長(zhǎng)，在初步PCR擴(kuò)增和拼接的過(guò)程中，發(fā)生了基因突變，1 237位堿基由A突變?yōu)門，形成了一個(gè)終止密碼子TGA，無(wú)法正確表達(dá)此融合蛋白。為此改用Kodplus高保真酶對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序沒(méi)有發(fā)生堿基的突變。構(gòu)建原核表達(dá)體系一般需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。本試驗(yàn)在融合蛋白表達(dá)的過(guò)程中嘗試了多種可溶性原核表達(dá)載體，都沒(méi)有得到相應(yīng)的可溶性表達(dá)或表達(dá)量太低。在經(jīng)過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)條件的篩選、優(yōu)化后，最后選取原核表達(dá)載體pET-Trx，在37℃，IPTG濃度為0.7mmol/L，誘導(dǎo)3h時(shí)獲得較高的表達(dá)。由于表達(dá)產(chǎn)物以不溶的包涵體形式存在，該融合蛋白需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的包涵體溶解、變性、復(fù)性過(guò)程，這極大的影響了融合蛋白的生物學(xué)活性，導(dǎo)致在目前建立的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)凝集的時(shí)間較長(zhǎng)，與人血型檢測(cè)的速度相比仍有一定的差距，估計(jì)與2E8kKg雙功能融合蛋白生物學(xué)活性不高有關(guān)。為此本試驗(yàn)擬從以下3個(gè)方面進(jìn)行研究，一是篩選不同的宿主菌株；二是在2E8scFv與RV-Kg基因兩個(gè)功能區(qū)之間引入一個(gè)連接肽，以克服因直接拼接，造成兩個(gè)功能區(qū)相互遮掩而導(dǎo)致活性下降的可能。三是繼續(xù)尋找新的可溶性表達(dá)系統(tǒng)及可溶性表達(dá)條件，達(dá)到獲得雙功能融合蛋白的可溶性表達(dá)，減少因包涵體變性、復(fù)性造成活性降低的目的。

［1］Balsamo GA，Ratard R，Claudet A.The epidemiology of animal bite，scratch，and other potential rabies exposures，Louisiana［J］.J La State Med Soc，2009，161（5）：260-265.

［2］Gaudin Y，Ruigrok RWH，Tuffereau C，et al.Rabies virus glycoprotein is a trimer［J］.Virology，1992，187 （2）：627-632.DOI：10.1016/0042-6822（92）90465-2

［3］Benmansour A，Leblois H，Coulon P，et al.Antigenicity of rabies virus glycoprotein［J］.J Virol，1991，65（8）：4198-4203.

［4］Yin Z，Liu JH.Animal Virology［M］.2ndedition.Beijing：Science Press，1997：780-781.（in Chinese）殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社.1997：780-781.

［5］Hu Y，Yang JY，Zhu L，et al.Expression，purification and characterization of an anti-human RBC scFv-HIV gpl60fusion protein for hemagglutination-based rapid detection of antibodies to HIV in whole blood［J］.Chin J Exp Clin Virol，2007，21（1）：76-78.（in Chinese）胡燕，楊健洋，朱雷，等.抗人紅細(xì)胞抗體和HIV抗原融合蛋白的構(gòu)建及活性鑒定［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2007，21（1）：76-78.

［6］Gupta A，Chaudhary VK.Whole-blood agglutination assay for on-site detection of human immunodeficiency virus infection［J］.J Clin Microbiol，2003，41（7）：2814-2817.DOI：10.1128/JCM.41.7.2814-2821.2003

［7］Siedenr M，Zapirz V，Ishida M，et al.Performance of rapid syphilis tests in venous and fingerstick whole blood specimens［J］.Sex Transm Dis，2004，31（9）：557-560.DOI：10.1097/01.olq.0000137903.48413.5e

［8］Li H，Pan JC，Liu Z，et al.Preparation and characterization of non-agglutinating mAbs against membrane antigen on human erythrocytes［J］.J Cell Mol Immunol，2005，21（4）：473-475.（in Chinese）李卉，潘紀(jì)春，劉子，等.抗人紅細(xì)胞膜抗原非凝集型單克隆抗體的研制及特性鑒定［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21（4）：473-475.

［9］Liao WJ，Qin SM，Wu JM，et al.Construction and biological activity detection of an anti-human red blood cell single chain fragment variable-pseudorabies virus gE bifunctional fusion protein［J］.J Agr Biotechnol，2010，18（3）：562-566.（in Chinese）DOI：10.3969/j.issn.1674-7968.2010.03.023廖文軍，覃紹敏，吳健敏，等.抗人紅細(xì)胞單鏈抗體（scFv）-偽狂犬病毒（PRV）-gE蛋白雙功能融合蛋白的構(gòu)建及生物學(xué)活性檢測(cè)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18（3）：562-566.DOI：10.3969/j.issn.1674-7968.2010.03.023

［10］Qin SM，Bai AB，Wu JM，et al.Preparation and bioactivity of anti-human red blood cell scFv and CSFV E2bifunctional fusion protein［J］.Chin J Biotech，2010，26（1）：28-34.（in Chinese）覃紹敏，白安斌，吳健敏，等.抗人紅細(xì)胞單鏈抗體與豬瘟E2蛋白雙功能融合蛋白的構(gòu)建及生物學(xué)活性檢測(cè)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（1）：28-34.

［11］Shao CL，Shi LJ，Yao ZX，et al.Cloning and expression of the variable region genes of the monoclonal antibody against H antigen on human erythrocyte［J］.J Immunol，2008，24（2）：238-242.（in Chinese）邵長(zhǎng)利，史利軍，姚站馨，等.抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因克隆和表達(dá)［J］.免疫學(xué)雜志，2008，24（2）：238-242.

［12］Li ZS，Liu AL，Tan RR，et al.Research development of rabies［J］.China Anim Husbandry Vet Med，2010，37（7）：189-191.（in Chinese）李澤盛，劉愛(ài)林，譚榮榮，等.狂犬病研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī).2010，37（7）：189-191.