周松峰,廖文軍,覃紹敏,袁書(shū)智,白安斌,吳健敏
狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性人畜共患傳染病。所有溫血?jiǎng)游锒伎筛腥荆袢∫坏┌l(fā)病,病死率幾乎100%[1],是人類病死率最高的急性傳染病之一??袢〔《綠基因編碼的糖蛋白(glycoprotein,GP)是病毒唯一暴露在表面的蛋白[2],是唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的病毒蛋白[3],在狂犬病毒致病和免疫中起著關(guān)鍵作用[4]。
狂犬病的診斷方法目前主要有中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等,但這些檢測(cè)方法對(duì)儀器和專業(yè)人員的依賴性較高,檢測(cè)成本昂貴,且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),極大的限制了它們?cè)诨鶎訂挝坏膽?yīng)用,由于我國(guó)面積遼闊,農(nóng)村散養(yǎng)犬較多,在開(kāi)展RV的監(jiān)測(cè)及免疫效果評(píng)估時(shí),急需建立一種快速、敏感、穩(wěn)定,可以現(xiàn)場(chǎng)使用的檢測(cè)方法。
近年來(lái)自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)發(fā)展迅速[5],已在多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[6-7]。該方法的基本原理是:以紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞,利用基因工程方法構(gòu)建一種重組雙功能融合蛋白(目標(biāo)抗原或抗體與紅細(xì)胞非凝集型抗體[8]聯(lián)結(jié)而形成的抗原-抗體或抗體-抗體結(jié)合物),該融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體/抗原結(jié)合,通過(guò)樣品中被檢抗體/抗原的橋聯(lián)作用,使指示紅細(xì)胞發(fā)生凝集,根據(jù)指示紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象達(dá)到快速檢測(cè)的目的。
本實(shí)驗(yàn)室利用該技術(shù)成功建立了檢測(cè)豬瘟、豬偽狂犬病毒的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[9-10]。因此本試驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上利用(SOE)PCR技術(shù),將狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū)kg與抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體2E8scFv[11]拼接成雙功能融合基因,進(jìn)行表達(dá)復(fù)性并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行檢驗(yàn),構(gòu)建既能與人紅細(xì)胞結(jié)合,又能與RV抗體反應(yīng)的雙功能融合蛋白。目的是為了進(jìn)一步建立狂犬病毒抗體快速檢測(cè)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法。
1.1 重組質(zhì)粒、載體、菌株和血清 重組質(zhì)粒pMD-G(含有狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū))、鼠抗RV高免血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈(zèng);重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv(含有抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因)[11]由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所章金剛研究員惠贈(zèng);原核表達(dá)載體pET-TrX、表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS均由本實(shí)驗(yàn)室保存;7份RV陽(yáng)性血清、7份RV陰性血清、犬細(xì)小病毒(CPV)陽(yáng)性血清、犬瘟熱病毒(CDV)陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 主要試劑 Kod-plus高保真酶為TOYOBO(日本)產(chǎn)品;T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、及TaqDNA 聚合酶均購(gòu)自 TaKaRa(日本)公司;IPTG購(gòu)自Promega公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG為Beyotime產(chǎn)品;Ni-NTA蛋白純化樹(shù)脂為QIAGEN公司產(chǎn)品;氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽均為Sigma公司產(chǎn)品;其它化學(xué)試劑均為南寧(中國(guó))生化藥品儀器公司分析純產(chǎn)品。
1.3 重組PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)重疊延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因與2E8scFv基因序列,設(shè)計(jì)4條重組PCR引物 (表1)。其中引物2E8scFv-U/2E8scFv-D用于擴(kuò)增合成2E8scFv基因,引物Kg-U/Kg-D用于擴(kuò)增合成Kg基因。2E8scFv3′末端15個(gè)堿基和Kg5′端15個(gè)堿基為互補(bǔ)序列(陰影部分)用于基因的拼接,拼接順序?yàn)?E8-Kg。2E8scFv-U 和 Kg-D中的下劃線部分為引入的BamH I、EcoR I酶切位點(diǎn)。
表1 2E8scFv、Kg基因引物序列Tab.1 Primers of 2E8scFv and Kg
1.4 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以2E8scFV-U/2E8scFV-D和 Kg-U/Kg-D為引物,從pMD-2E8scFv和pMD-G重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增融合基因2E8Kg的5′端片段2E8scFv和3′端片段Kg基因。PCR擴(kuò)增條件均為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1min,60℃退火30s,72℃延伸70 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。以純化后的2E8scFv和Kg基因?yàn)槟0?,采用(SOE)PCR方法拼接成2E8Kg融合基因。第一輪PCR反應(yīng)體系為:2E8scFv和 Kg基因各0.5μL、10× Buffer2.5 μL、5U/μL KOD-plus高保真酶0.5μL,10mmol/L dNTPs 2.5μL、用滅菌雙蒸水加至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性1 min,60℃退火1min,72℃延伸2min,7個(gè)循環(huán)。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)結(jié)束后,在反應(yīng)體系中加入引物2E8scFv-U和 Kg-D各0.5μL,然后95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1min,60℃退火1min,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。將上述PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T Simple載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序正確后將融合基因2E8kg亞克隆到原核表達(dá)載體pET-Trx中,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-2E8kg。
1.5 2E8Kg融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將鑒定正確的pET-Trx-2E8Kg原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)pLysS中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證其是否表達(dá),用Band-Scan軟件測(cè)定目的蛋白相對(duì)含量。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)菌液,用細(xì)菌洗滌液初步洗滌后,加入細(xì)裂解液作用30min后用細(xì)胞破碎儀菌破碎處理3遍,分別收集沉淀和上清,沉淀用包涵體洗滌液洗滌兩遍后,用包涵體溶解液溶解,將上述溶解液和上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,進(jìn)行可溶性分析。
1.6 2E8Kg融合蛋白的純化與復(fù)性 將誘導(dǎo)菌液擴(kuò)大培養(yǎng),按上述方法制備包涵體后,采用親和層析法和谷胱甘肽再氧化法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性,復(fù)性24h后,用透析液透析48h,每6h換液一次,透析袋內(nèi)的液體即為純化和復(fù)性后的蛋白。用PEG20000濃縮復(fù)性蛋白,并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其濃度。
1.7 2E8kg融合蛋白的 Western-blot檢測(cè) 將純化后的2E8kg融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上,將膜用封閉液(5%的脫脂奶粉)4℃封閉過(guò)夜,用TBST洗滌,一抗加入鼠抗RV高免血清,二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG,最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色液顯色,邊搖動(dòng)邊觀察,至條帶清晰后加入雙蒸水終止其反應(yīng),觀察結(jié)果。
1.8 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)2E8kg融合蛋白的雙功能生物學(xué)活性 取7份RV陽(yáng)性血清,同時(shí)設(shè)7份RV陰性血清作對(duì)照,取96孔血凝板,每孔中加入50μL,然后再向每個(gè)孔中依次加入10μL雙功能融合蛋白(1.2mg/mL)和20μL 2%O型人紅細(xì)胞,混勻后靜置30min觀察結(jié)果;分別取A、B、AB型人紅細(xì)胞,按同樣的方法操作,觀察結(jié)果。
2.1 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv和pMD-G為模板,分別擴(kuò)增出兩條大小分別為732bp和999bp的目的片段,命名為2E8scFv和Kg(如圖1),與預(yù)期擴(kuò)增片段一致。以瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段2E8scFv和Kg為模板,通過(guò)(SOE)PCR拼接成2E8Kg融合基因,將其克隆到pMD18-T Simple載體上,鑒定正確后插入原核表達(dá)載體pET-Trx,通過(guò)PCR(如圖2)及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明該片段與融合基因2E8Kg一致,大小為1 731bp且讀碼框正確。表明融合基因和原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
圖1 目的基因2E8scFv和Kg的PCR擴(kuò)增圖M:DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量;1:Kg基因;2:2E8scFv基因Fig.1 PCR amplification of 2E8scFv and Kg genesM:DNA Marker 2000;1:Kg gene;2:2E8scFv gene
圖2 融合基因2E8Kg的SOE-PCR擴(kuò)增圖M.DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量;1.2E8Kg融合基因Fig.2 Amplification of 2E8Kg fusion gene by SOE-PCRM:DNA Marker 2000;1:2E8Kg fusion gene
2.2 2E8Kg融合蛋白的表達(dá)、可溶性分析、復(fù)性及純化 取pET-Trx-2E8Kg陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)設(shè)pET-Trx空載體轉(zhuǎn)化菌為對(duì)照,結(jié)果在37℃,IPTG 濃度為0.7mmol/L,誘導(dǎo)3h時(shí)獲得最大表達(dá),表達(dá)量占菌體蛋白總量23.5%左右。SDS-PAGE分析表明,表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶的包涵體形式存在,相對(duì)分子質(zhì)量約77.7kD(如圖3),與預(yù)期蛋白分子大小一致。利用親和層析法對(duì)變性溶解的目的蛋白進(jìn)行純化并用BandScan生物學(xué)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明目的蛋白洗脫后的純度提高到了98.9%(圖略)。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定復(fù)性濃縮后蛋白含量約為1.7mg/mL。
圖3 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳的結(jié)果M.低分子量蛋白marker;1.空載體對(duì)照;2.誘導(dǎo)后重組菌蛋白Fig.3 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by SDS-PAGEM:Protein MW marker;1:Negative control;2:Recombinant bacteria protein after induction
2.3 2E8Kg融合蛋白 Western-blot檢測(cè) 用RV高免血清對(duì)2E8Kg融合蛋白進(jìn)行 Western-blot檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)約在77.7kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶,而同時(shí)用CPV和CDV陽(yáng)性血清對(duì)2E8Kg融合蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè),結(jié)果無(wú)任何免疫印跡條帶出現(xiàn)(圖4),說(shuō)明2E8kg融合蛋白能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng),具有良好的免疫反應(yīng)原性。
2.4 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)2E8Kg融合蛋白的生物學(xué)活性 用純化和復(fù)性后的2E8Kg融合蛋白、2%人“O”型紅細(xì)胞、7份RV陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),結(jié)果7份RV陽(yáng)性血清均可觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象(圖5),而7份RV陰性血清未觀察到凝集現(xiàn)象(圖6)。用血型定型試劑盒篩選出A、B和AB型人紅細(xì)胞與RV陽(yáng)性血清進(jìn)行同樣的試驗(yàn),結(jié)果也觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象(圖7)。用CPV,CDV陽(yáng)性血清分別與2E8Kg融合蛋白作用,結(jié)果未發(fā)生凝集(圖8)。上述結(jié)果說(shuō)明2E8Kg融合蛋白不但能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng),而且能與人紅細(xì)胞結(jié)合(無(wú)血型限制),具有雙功能特性。
圖4 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blot鑒定M.低分子量蛋白 marker;a.空載體對(duì)照;b.誘導(dǎo)后pET-Trx-2E8Kg重組菌蛋白;c.CPV陽(yáng)性血清陰性對(duì)照;d.CDV陽(yáng)性血清陰性對(duì)照。Fig.4 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by Western-blotM:Protein MW marker;a:Negative control;b:Recombinant bacteria pET-Trx-2E8Kg protein after induction;c:Negative control of CPV positive serum;d:Negative control of CDV positive serum
圖5 狂犬病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.5 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro-tein,RV positive serum,and O type human red blood cells;
圖6 狂犬病毒陰性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.6 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro-tein,RV negative serum,and O type human red blood cells;
圖7 狂犬病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.7 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro-tein,RV positive serum,and human red blood cells;
圖8 犬不同病毒陽(yáng)性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)Fig.8 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro-tein,different virus-positive serum of dog,and O type human red blood cells.
狂犬病是人畜共患的自然疫源性傳染病,目前尚無(wú)有效的治療方法,疫苗免疫預(yù)防狂犬病的發(fā)生尤其重要[12]。我國(guó)狂犬病發(fā)病死亡人數(shù)位居重點(diǎn)傳染病死亡數(shù)和病死率榜首,易感動(dòng)物發(fā)病呈逐年上升的趨勢(shì),要徹底根除狂犬病,首先就必須消滅動(dòng)物的狂犬病,特別是隱性帶毒動(dòng)物及野生動(dòng)物的狂犬病。針對(duì)狂犬病的現(xiàn)狀,如何利用有效的診斷方法對(duì)隱性帶毒動(dòng)物快速診斷,對(duì)狂犬病疫苗免疫后的動(dòng)物進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)及免疫效果評(píng)估,是保證人和動(dòng)物安全的當(dāng)務(wù)之急。
目前,狂犬病現(xiàn)有的診斷方法對(duì)儀器和專業(yè)人員的要求較高,檢測(cè)成本昂貴,且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),因而極大的限制了它們?cè)诨鶎訂挝坏氖褂谩亩鴮?dǎo)致動(dòng)物狂犬病免疫效果評(píng)估的工作開(kāi)展較為困難,這對(duì)控制和消滅動(dòng)物狂犬病十分不利。自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)以其快速、簡(jiǎn)便、不需要任何儀器,僅憑肉眼就可以觀察結(jié)果的特點(diǎn)在人類疾病快速診斷中得到了較好的應(yīng)用。由于犬紅細(xì)胞表面抗原十分復(fù)雜,要尋找到各類血型的共有抗原十分困難,為此,本研究借助表面抗原背景清楚的人紅細(xì)胞作為指示劑建立檢測(cè)動(dòng)物病原抗體的紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)方法。
由于本實(shí)驗(yàn)拼接的融合基因長(zhǎng)度較長(zhǎng),在初步PCR擴(kuò)增和拼接的過(guò)程中,發(fā)生了基因突變,1 237位堿基由A突變?yōu)門,形成了一個(gè)終止密碼子TGA,無(wú)法正確表達(dá)此融合蛋白。為此改用Kodplus高保真酶對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序沒(méi)有發(fā)生堿基的突變。構(gòu)建原核表達(dá)體系一般需要綜合考慮3大因素:表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。本試驗(yàn)在融合蛋白表達(dá)的過(guò)程中嘗試了多種可溶性原核表達(dá)載體,都沒(méi)有得到相應(yīng)的可溶性表達(dá)或表達(dá)量太低。在經(jīng)過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)條件的篩選、優(yōu)化后,最后選取原核表達(dá)載體pET-Trx,在37℃,IPTG濃度為0.7mmol/L,誘導(dǎo)3h時(shí)獲得較高的表達(dá)。由于表達(dá)產(chǎn)物以不溶的包涵體形式存在,該融合蛋白需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的包涵體溶解、變性、復(fù)性過(guò)程,這極大的影響了融合蛋白的生物學(xué)活性,導(dǎo)致在目前建立的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)凝集的時(shí)間較長(zhǎng),與人血型檢測(cè)的速度相比仍有一定的差距,估計(jì)與2E8kKg雙功能融合蛋白生物學(xué)活性不高有關(guān)。為此本試驗(yàn)擬從以下3個(gè)方面進(jìn)行研究,一是篩選不同的宿主菌株;二是在2E8scFv與RV-Kg基因兩個(gè)功能區(qū)之間引入一個(gè)連接肽,以克服因直接拼接,造成兩個(gè)功能區(qū)相互遮掩而導(dǎo)致活性下降的可能。三是繼續(xù)尋找新的可溶性表達(dá)系統(tǒng)及可溶性表達(dá)條件,達(dá)到獲得雙功能融合蛋白的可溶性表達(dá),減少因包涵體變性、復(fù)性造成活性降低的目的。
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