羅曉東，沈二霞，陳代雄，丁 雪，李 華

廣州管圓線蟲作為一種新發(fā)傳染病的病原，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎。近年來在我國浙江、遼寧、福建、云南和北京等地先后出現(xiàn)廣州管圓線蟲病的暴發(fā)流行［1－2］，其重要性已越來越引起醫(yī)學(xué)界的重視。而宿主感染后產(chǎn)生的針對廣州管圓線蟲的免疫應(yīng)答的研究，對于我們了解宿主抗損害作用的特點(diǎn)、蟲體的致病機(jī)制和免疫學(xué)診斷等有重要意義。脾臟是哺乳動物最大的外周免疫器官和血源性抗原最主要的免疫應(yīng)答場所，也是包括淋巴細(xì)胞在內(nèi)許多免疫細(xì)胞定居區(qū)域。而感染后脾臟淋巴細(xì)胞學(xué)的改變能較好地反映宿主對寄生蟲免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。因此，本研究以小鼠為動物模型，采用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法對其感染廣州管圓線蟲后脾臟T淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子分泌水平的變化進(jìn)行了觀察。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性4～6周齡的BALB/c小鼠，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、Hank’s液購自英維捷基公司；胎牛血清購自杭州四季清公司；Saponin、離子霉素及Brefeldin A（BFA）均購自Sigma公司；PerCP抗小鼠CD4單克隆抗體、FITC抗小鼠CD8a單克隆抗體、APC抗小鼠IL-4、APC抗小鼠IFN－γ、PE抗小鼠IL-17均購自BD公司；PMA 購自杭州聯(lián)科公司；IL-4（DY404）、IL-17（DY421）ELISA檢測試劑盒購自R＆D公司。流式檢測采用BD公司Calibur流式細(xì)胞儀。ELx800型酶標(biāo)儀由BioTek儀器公司生產(chǎn)。1267P型CO2培養(yǎng)箱由上海易亮醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

2 方 法

2.1 感染動物模型的建立 褐云瑪瑙螺由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)和人工感染。從感染褐云瑪瑙螺中分離廣州管圓線蟲第3期幼蟲，主要參照陳代雄等［3］報道的方法進(jìn)行。將小鼠隨機(jī)分成3組，包括：對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組每組各10只鼠。其中對照組為正常小鼠，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組分別感染廣州管圓線蟲第3期幼蟲20條/鼠和40條/鼠，感染采用腹腔注射法。

2.2 小鼠一般情況 感染后觀察各組小鼠活動、飲食及毛色等變化。

2.3 脾臟淋巴細(xì)胞分離 分別于感染后的第19d和第25d前后，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒小鼠腹部，在無菌條件下取出脾臟；脾臟淋巴細(xì)胞的收集使用Anukumar B等［4］報告的方法，將收集的脾淋巴細(xì)胞用4mL RPMI1640培養(yǎng)液重懸，0.4%臺盼藍(lán)染色，鏡下計數(shù)。

2.4 脾臟淋巴細(xì)胞流式檢測 參照Anukumar B［4］、楊濱燕等［5］的方法，將收集的脾淋巴細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×106/mL，加入PMA 10ng/mL及離子霉素（Ionomycin）1μg/mL，于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h；加入BFA 1μL后繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后加4%甲醛固定，加含通透劑Saponin的緩沖液重懸細(xì)胞，4℃過夜。將細(xì)胞分裝入流式管中，每管含細(xì)胞數(shù)約1×106/mL，加入相應(yīng)的熒光抗體各1μL。流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞，按儀器使用規(guī)程進(jìn)行操作。

2.5 細(xì)胞因子ELISA檢測 將分離的脾淋巴細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×106/mL，加入PMA 10ng/mL及Ionomycin 1μg/mL后，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每份細(xì)胞懸液同時做3孔培養(yǎng)，每孔200μL；于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后取出并保存于－80℃。脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL－4和IL-17的雙抗夾心ELISA檢測，方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。每樣本同時進(jìn)行3孔平行檢測，檢測值取3孔平均值；ELISA檢測OD值按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)組和對照組的顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理，采用的統(tǒng)計學(xué)方法包括方差分析、t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 小鼠一般情況 對照組小鼠一般狀況良好，攝食活動正常。實(shí)驗(yàn)組于感染第16d后，陸續(xù)出現(xiàn)打轉(zhuǎn)、癱瘓等中樞神經(jīng)受損的表現(xiàn)。

3.2 脾臟T淋巴細(xì)胞流式檢測結(jié)果

3.2.1 CD4＋T細(xì)胞 檢測結(jié)果見圖1。對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（15.79±5.57）%、（21.32±7.31）%和（25.25±10.74）%，3組間脾CD4＋T細(xì)胞均值存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（F＝3.446，P＜0.05）；其中，對照組與實(shí)驗(yàn)2組間存在顯著性差異（t＝2.474，P＜0.05），而對照組與實(shí)驗(yàn)1組、兩實(shí)驗(yàn)組之間均無顯著性差異（t＝1.906，P＞0.05；t＝1.013，P＞0.05）。

3.2.2 CD8＋T細(xì)胞 檢測結(jié)果見圖2。對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（2.51±0.60）%、（3.25±1.31）%和（3.76±1.58）%。與對照組比較，感染后小鼠脾臟CD8＋T細(xì)胞水平呈上升趨勢，但3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝2.582，P＞0.05）。

3.2.3 CD4＋I(xiàn)L-4＋T細(xì)胞 如圖3所示，對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（0.64±0.25）%、（1.94±2.31）%、（2.49±2.38）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3組間存在顯著性差異（χ2＝7.770，P＜0.05）；其中，對照組與兩實(shí)驗(yàn)組間均存在顯著性差異（Z＝2.342，P＜0.05；Z＝2.440，P＜0.05）；兩實(shí)驗(yàn)組間無統(tǒng)計學(xué)差異（Z＝0.832，P＞0.05）。

圖1 脾臟CD4＋T細(xì)胞百分率Fig.1 Percentage of CD4＋ T cells in spleen

圖2 脾臟CD8＋T細(xì)胞百分率Fig.2 Percentage of CD8＋ T cells in spleen

圖3 脾臟CD4＋I(xiàn)L-4＋T細(xì)胞百分率Fig.3 Percentage of CD4＋I(xiàn)L-4＋T cells in spleen

3.2.4 CD4＋I(xiàn)L-17＋T細(xì)胞 如圖4所示，對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組的檢測值分別為（1.18±0.26）%、（0.63±0.16）%和（0.65±0.29）%，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.620，P＜0.05）。其中，對照組與實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組間均存在顯著差異（t＝5.416，P＜0.05；t＝3.783，P＜0.05），而兩實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著（t＝0.223，P＞0.05）。

圖4 脾臟CD4＋I(xiàn)L-17＋T細(xì)胞百分率Fig.4 Percentage of CD4＋I(xiàn)L-17＋T cells in spleen

3.2.5 CD4＋I(xiàn)FN-γ＋T 細(xì)胞 如圖5所示，對照組、實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（12.47±2.49）%、（5.80±2.39）%和（5.66±3.08）%。這3個組之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（F＝15.695，P＜0.05），其中，對照組與實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組間均存在顯著性差異（t＝5.386，P＜0.05；t＝4.716，P＜0.05），而兩實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著（t＝0.114，P＞0.05）。

圖5 脾臟CD4＋I(xiàn)FN-γ＋T細(xì)胞百分率Fig.5 Percentage of CD4＋I(xiàn)FN-γ＋T cells in spleen

3.3 脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測

3.3.1 IL-4含量檢測 結(jié)果見圖6，對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（215.20±158.13）pg/mL、（453.43±246.07）pg/mL、（469.42±221.37）pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3組間有顯著性差異（χ2＝7.531，P＜0.05）；其中，對照組與實(shí)驗(yàn)1組或?qū)嶒?yàn)2組間均存在顯著差異（Z＝2.146，P＜0.05；Z＝2.148，P＜0.05），而兩實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異（t＝0.153，P＞0.05）。

圖6 IL-4含量檢測Fig.6 Levels of IL-4in spleen cell supernatants

3.3.2 IL-17含量檢測 結(jié)果見圖7。對照組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組檢測值分別為（378.47±263.14）pg/mL、（97.85±95.41）pg/mL、（67.36±63.17）pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3組間有顯著性差異（χ2＝12.746，P＜0.05）；其中，對照組與實(shí)驗(yàn)1組或?qū)嶒?yàn)2組間均存在顯著差異（Z＝3.027，P＜0.05；Z＝3.222，P＜0.05）；而兩實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異（Z＝0.529，P＞0.05）。

圖7 IL-17含量檢測Fig.7 Levels of IL-17in spleen cell supernatants

3.4 感染后不同時間免疫學(xué)檢測結(jié)果比較

3.4.1 流式檢測結(jié)果 見表1。實(shí)驗(yàn)1組小鼠CD4＋T細(xì)胞值感染后第25d稍高于第19d，而實(shí)驗(yàn)2組則是第19d高于第25d；但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，均無顯著性差異（P＞0.05）。此外，脾CD4＋T細(xì)胞中的IL-4＋、IL-17＋、IFN-γ＋細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組均為感染后第25d高于第19d，但均無統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異（P＞0.05）。

表1 感染后不同時間流式與ELISA檢測結(jié)果Tab.1 Results of Flow Cytometry and ELISA for different time points after infection

3.4.2 ELISA檢測結(jié)果 見表1。實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組小鼠感染后不同時間脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IL-4水平均無統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異（t＝0.498，P＞0.05；Z＝0.104，P＞0.05）。而兩實(shí)驗(yàn)組IL-17水平，在感染第19d和第25d間亦無統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異（t＝0.765，P＞0.05；t＝1.002，P＞0.05）。

4 討 論

已有的研究［6－7］顯示，廣州管圓線蟲感染后宿主的免疫應(yīng)答對于自身保護(hù)和蟲體的致病作用非常重要。T淋巴細(xì)胞包括CD4＋的輔助性T細(xì)胞和CD8＋的細(xì)胞毒性T細(xì)胞等亞群。CD4＋T細(xì)胞主要生物學(xué)功能是激發(fā)和調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答；CD8＋T細(xì)胞主要作用是對靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CD4＋T淋巴細(xì)胞檢測值與對照組比較顯著升高，而CD8＋T淋巴細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)組雖高于對照組，但變化不顯著，提示在廣州管圓線蟲感染后早中期的免疫應(yīng)答中，CD4＋T淋巴細(xì)胞可能起主要作用。這與Lee JD等［8］報告的結(jié)果基本一致。

輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）又可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，兩者在免疫應(yīng)答過程中分泌不同的細(xì)胞因子；這些細(xì)胞因子有不同的功能，且相互拮抗，因此，占主導(dǎo)地位的Th細(xì)胞類型及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子將決定感染的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸［9－12］。IL-4主要是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，其生物學(xué)作用為促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體以及誘導(dǎo)抗體的類別轉(zhuǎn)換；IL-4還以自分泌方式促進(jìn)Th2細(xì)胞的增殖與功能。流式檢測結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組CD4＋I(xiàn)L-4＋T細(xì)胞含量明顯高于對照組。同時脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-4含量檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組也明顯高于對照組，兩者結(jié)果一致。也與Sugaya H等［6］報告的結(jié)果基本相符。

IL-17是最近幾年受到關(guān)注的一類細(xì)胞因子，關(guān)于其在廣州管圓線蟲感染中的變化暫未見文獻(xiàn)報告。該因子主要由CD4＋T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞［13］產(chǎn)生，它通過誘導(dǎo)IL-6、TNF-α，以及趨化因子（如MCP-1、MIP-2）的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)及血管的生成［14］。在流式檢測結(jié)果中，CD4＋I(xiàn)L-17＋T 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，而在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-17的含量亦是實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組。這可能與宿主感染廣州管圓線蟲后高表達(dá)的IL-4對于Th17細(xì)胞分化的抑制作用，從而抑制IL-17的分泌［13］有關(guān)。

IFN-γ主要由活化的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。在寄生蟲感染中，其主要對胞內(nèi)寄生原蟲感染發(fā)揮作用［15－17］。流式檢測結(jié)果顯示，小鼠脾臟CD4＋I(xiàn)FN-γ＋淋巴細(xì)胞亞群檢測值實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組。這可能是由于小鼠感染廣州管圓線蟲后，CD4＋I(xiàn)L-4＋T細(xì)胞及IL-4的顯著升高對其產(chǎn)生的負(fù)調(diào)節(jié)作用。因?yàn)橛醒芯浚?0］表明，IL-4能通過抑制STAT1的表達(dá)，從而抑制Th1細(xì)胞的分化和增殖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染后上調(diào)性免疫因子包括CD4＋T、CD8＋T、IL-4＋T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子IL－4水平均隨著感染程度的增加而上升，而下調(diào)性免疫因子包括IFN-γ＋細(xì)胞和細(xì)胞因子IL-17檢測值則隨著感染程度的增加而下降，但差異均無統(tǒng)計學(xué)上的顯著性；提示感染程度對T細(xì)胞亞群變化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生有一定的影響，但影響程度有限。

為了解感染后不同時間脾CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化，我們對實(shí)驗(yàn)組感染后第19d和第25d兩個時間點(diǎn)的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在流式檢測中，CD4＋T淋巴細(xì)胞中的IL-4＋、IL-17＋、IFN-γ＋亞群，感染后隨時間延長兩實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)為水平升高。在另一方面，細(xì)胞因子IL-4和IL-17的ELISA檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)1組為第19d高于第25d，實(shí)驗(yàn)2組則為第19d低于第25d，是否是由于感染程度的差異導(dǎo)致的細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化，值得進(jìn)一步探討。總之，本實(shí)驗(yàn)感染后第19d和第25d兩個時間點(diǎn)小鼠的檢測結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（P＞0.05）；因此，感染后不同時間脾CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的變化特點(diǎn)，還有待擴(kuò)大樣本做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，小鼠感染廣州管圓線蟲后，表現(xiàn)以脾臟CD4＋T淋巴細(xì)胞大量增殖和Th2型細(xì)胞極化為特點(diǎn)。一般認(rèn)為，抗體依賴的、嗜酸性粒細(xì)胞作為主要效應(yīng)細(xì)胞的ADCC作用是人體主要的殺傷蠕蟲機(jī)制［18］。而嗜酸性粒細(xì)胞升高是廣州管圓線蟲感染的主要特征，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)觀察到的感染后Th2極化現(xiàn)象（Th2細(xì)胞的主要功能之一是促進(jìn)抗體生成和介導(dǎo)體液免疫），我們推測上述ADCC效應(yīng)也應(yīng)該是小鼠抗廣州管圓線蟲感染的主要免疫應(yīng)答機(jī)制。本研究結(jié)果使我們對于廣州管圓線蟲感染后宿主免疫應(yīng)答的特性有了進(jìn)一步的了解。

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