李亞杰,施江,胥華偉,張淑玲,霍志鵬,王建章

（1.河南科技大學農學院,河南洛陽471000；2.洛陽國際牡丹園,河南洛陽471000）

牡丹Paeonia suffruticosa屬芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia,多年生落葉小灌木,又名洛陽花、富貴花,具有很高的觀賞價值和栽培價值[1].但是牡丹的自然花期較短,最佳觀賞期僅2～3 d,遠遠不能滿足人們旅游觀賞的需要,所以探討牡丹花期的衰老機理和如何延長牡丹花期顯得非常重要.牡丹為乙烯敏感型花卉[2],內源激素的改變常常會帶來一系列的生理生化變化,蛋白質作為生命活動的體現(xiàn)者,常在植物衰老過程中變化顯著,因此被認為是重要的衰老指標之一[3].而脯氨酸作為一種滲透調節(jié)物質,一方面可以緩解脅迫帶來的滲透壓,另一方面還可以清除O2-、OH-等活性氧,維持蛋白質的正常結構,此外,它還可以作為一種生長發(fā)育信號,調控植物的生長發(fā)育[4].因此本文選用不同花期類型牡丹,探討其葉和花中可溶性蛋白和脯氨酸含量在開花及衰老過程中的變化規(guī)律,希望能夠進一步豐富牡丹衰老機理的研究,為牡丹花期調控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為牡丹早花品種‘鳳丹白’、中花品種‘洛陽紅’和晚花品種‘玉樓點翠’,于2011年4-5月采自洛陽國際牡丹園.參照王榮花等的標準[5],將花朵發(fā)育時期劃分為露色期（Ⅰ期）、綻口期（Ⅱ期）、初開期（Ⅲ期）、半開期（Ⅳ期）、盛開期（Ⅴ期）和開始衰敗期（Ⅵ期）.從牡丹植株上采切不同發(fā)育階段葉、花,用冰盒帶回實驗室,用于各項生理指標的測定.

1.2 試驗方法

1.2.1 可溶性蛋白含量的測定 稱取牡丹鮮樣0.2～0.5g,分3次總共加入5mL蒸餾水研磨勻漿,然后3000r/min離心10 min,取上清液0.1 mL于試管中,加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液,充分混合；放置5 min后在595 nm下比色,以5 mL考馬斯亮藍G-250溶液為CK,測定其吸光度,并通過以牛血清蛋白所作標準曲線求值,重復3次.根據(jù)以下公式計算其可溶性蛋白含量：

式中：C為查標準曲線值/μg,Vt為提取液總體積/mL,Vs為測定時的加樣量/mL,Mf為樣品鮮重/g.

1.2.1 脯氨酸含量的測定 將待測葉片擦拭干凈,剪碎混勻,分別稱取0.5 g,放入試管中,加入體積分數(shù)為3%的磺基水楊酸5 mL,在沸水浴中提取10 min,提取過程中要不停地搖動.取出試管冷卻以后過濾到干凈的試管中,濾液即為脯氨酸的提取液.吸取濾液2 mL于另一干凈的帶玻璃塞的試管中,并加入2 mL冰醋酸和2 mL體積分數(shù)為2.5%的酸性茚三酮,沸水浴中加熱30 min,溶液即呈紅色.冷卻后加入5 mL甲苯,震蕩30 s,靜置片刻,取上部甲苯萃取物質,以甲苯為空白對照,在分光光度計上520 nm波長下比色,測定其吸光值.測定2 mL待測液中脯氨酸的質量濃度（μg/2 mL）.根據(jù)以下公式計算脯氨酸含量：

式中：C為2 mL測定液中脯氨酸的質量濃度/（μg/g）,Vt為提取液總體積/mL,Vs為測定時的加樣量/mL,Mf為樣品鮮重/g.

2 結果與分析

2.1 牡丹花期可溶性蛋白含量的變化

牡丹葉片中可溶性蛋白含量測定結果見圖1.

圖1 牡丹葉片中可溶性蛋白含量的變化

由圖1可知,在開花前期,3種牡丹葉片中可溶性蛋白含量略有上升,總體浮動不大,這是由于葉片自身的生長需要維持較高的蛋白質,以滿足其生理功能；在開花后期葉片蛋白質含量波動不大,說明牡丹葉片在花期沒有出現(xiàn)衰老的顯著特征,這與觀察現(xiàn)象一致.

牡丹花瓣中可溶性蛋白含量測定結果見圖2.

圖2 牡丹花瓣中可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知,‘洛陽紅’和‘玉樓點翠’花瓣蛋白質含量略有上升,說明花瓣有蛋白質的合成,滿足其強烈的開花需求及細胞增長,而從Ⅱ期后開始逐漸下降,‘鳳丹白’花瓣蛋白質含量則隨花期持續(xù)下降,表明隨牡丹花瓣的衰老,有機質大量分解,異化作用加強,花瓣可溶性蛋白含量降低.‘鳳丹白’和‘玉樓點翠’末期出現(xiàn)上升趨勢,可能是隨著花的衰敗細胞活性降低,降解蛋白質的能力下降,水分蒸發(fā)導致含量上升.

2.2 牡丹花期脯氨酸含量的變化

牡丹葉片中脯氨酸含量的測定結果見圖3.

圖3 牡丹葉片中脯氨酸含量的變化

由圖3可知,3種牡丹葉片在露色期到始衰期的脯氨酸含量不同,變化趨勢較為一致,呈逐漸上升狀態(tài),‘鳳丹白’和‘洛陽紅’葉片升高較快,開花末期略有下降,‘玉樓點翠’脯氨酸含量則是前期較為平緩,開花末期急劇上升.分析認為在牡丹開花期,生殖生長較為旺盛,會抑制葉片的營養(yǎng)生長,而且葉片合成的有機物要向代謝旺盛的花瓣轉移,導致本身滲透勢降低,從而誘導脯氨酸合成系統(tǒng),提高脯氨酸含量,緩解低滲透勢帶來的傷害,隨著花朵的衰敗,生殖生長的抑制逐漸解除,脯氨酸含量出現(xiàn)下降趨勢.另外,進入4月下旬以后,溫度升高較快,最高達到37℃左右,晚花品種‘玉樓點翠’的葉片很可能受到高溫的脅迫,致使脯氨酸含量增加.

牡丹花瓣中脯氨酸含量的測定結果見圖4.

圖4 牡丹花瓣中脯氨酸含量的變化

由圖4可知,不同花期‘洛陽紅’花瓣脯氨酸含量較高,‘鳳丹白’次之,‘玉樓點翠’較少,3種牡丹花瓣脯氨酸含量整體呈下降趨勢,在開花前期‘鳳丹白’和‘洛陽紅’花瓣脯氨酸含量略有升高,然后逐漸下降,開花末期不同品種都略有上升.較高的脯氨酸含量可以降低細胞的滲透勢,促進細胞吸水和開花生長,另外,脯氨酸可以作為能量物質,為開花提供能量.

3 結論與討論

在植物的成熟器官中,蛋白質維持一種合成和分解的平衡狀態(tài),含量相對穩(wěn)定,但是隨著植物的衰老蛋白質就會降解,細胞結構逐漸破壞,最終走向死亡[6].牡丹為多年生小灌木,葉片和花瓣表現(xiàn)出不同步的衰老現(xiàn)象,牡丹花期一般在四、五月份,從開花到衰敗只有一周左右,而葉片生長周期較長,一般在十一月份左右脫落.許多研究認為蛋白質的含量是在植物衰老過程重要指標之一[3],本研究發(fā)現(xiàn)在牡丹花期葉片蛋白含量基本穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)衰老跡象,這與觀察現(xiàn)象相一致,而花瓣蛋白質含量則呈下降趨勢,蛋白質逐漸降解會破壞細胞的膜結構,增加膜透性,進一步導致細胞內代謝紊亂,清除O2-等氧自由基的功能受到抑制,膜質過氧化加劇,最終導致了細胞的死亡.

脯氨酸是植物在冰凍、干旱、高溫等脅迫條件下累積的主要有機分子,是一種重要的滲透調節(jié)物質.在植物的光合器官和生殖器官中,往往有較多的脯氨酸積累,既有助于降低滲透壓,提高細胞持水能力,還可以參與氧自由基的清除.此外,1分子脯氨酸氧化可以提供32個ATP,可以作為能量底物,脯氨酸有助于維持蛋白質結構的穩(wěn)定,這可能是植物對脅迫的生態(tài)適應[7].本試驗結果表明,葉片脯氨酸含量隨花期呈上升趨勢,而花瓣脯氨酸含量呈下降趨勢,后期略有上升.分析認為,在牡丹花期,花瓣的劇烈活動抑制葉片的營養(yǎng)生長,而葉片營養(yǎng)物質向花瓣的運輸進一步增長,誘導了脯氨酸的合成,開花后期隨著花瓣的衰敗生殖抑制逐漸解除,脯氨酸含量下降,晚花品種‘玉樓點翠’在開花后期葉片脯氨酸快速升高可能是受較高氣溫的影響[8]；花瓣在前幾個時期有較高的脯氨酸含量,說明脯氨酸促進了牡丹花瓣的吸水生長,在清除系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,減輕活性氧對細胞的傷害,并可能參與蛋白質的合成以及劇烈的呼吸作用,在線粒體中氧化提供能量并逐漸消耗,脯氨酸含量隨花期開始下降,半開期和盛花期脯氨酸含量較少,對細胞的持水作用減弱,活性氧積累,并加劇了蛋白質的降解,推進細胞結構的破壞,液泡當中的脯氨酸釋放加劇,而且蛋白質的降解一定程度上增加了開花后期脯氨酸的含量.研究認為外源脯氨酸可以提高植物的抗逆性,改變開花時間和延長花期[9],是否對牡丹有效有待進一步研究.

蛋白質的合成和脯氨酸的積累被認為是兩個相對獨立的過程,并不存在直接關系[10].本試驗發(fā)現(xiàn)葉片和花瓣中蛋白含量和脯氨酸含量沒有顯著相關性,與上述結論相一致.另外,在牡丹開花和衰老的過程中,不同時期葉片和花瓣中蛋白質和脯氨酸含量發(fā)生明顯的變化.這種變化與品種類型、源-庫關系、以及花瓣的程序性死亡、乙烯等激素的調控等相關聯(lián),并且與牡丹花的衰老相對應,因此蛋白質和脯氨酸含量變化可能在牡丹花衰老過程中起重要作用.

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