姚 英 陳代文 劉靜波 毛湘冰 毛 倩 余 冰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，雅安 625014)

作為多胎家畜，豬發(fā)生先天性宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)的概率最大，養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重受損，因此是否能通過營養(yǎng)手段緩解該癥狀和促進(jìn)IUGR個體正常生長對于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。肝臟作為機(jī)體最大的代謝器官之一，在養(yǎng)分代謝、生物合成和免疫防御等方面具有重要作用。IUGR發(fā)生時，細(xì)胞增殖較快的器官首先顯著受損，從而保證腦等器官的發(fā)育及機(jī)體的存活［1］。肝臟等器官的養(yǎng)分供應(yīng)減少、質(zhì)量減輕、結(jié)構(gòu)和功能受損［1－3］。研究發(fā)現(xiàn)IUGR會導(dǎo)致機(jī)體凋亡相關(guān)基因表達(dá)改變［4］，并可通過改變基因甲基化程度影響基因的表達(dá)和機(jī)體的生理代謝［5］。促凋亡相關(guān)基因腫瘤蛋白53(p53)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，當(dāng)它被激活可影響細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，而其中B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)是研究較多的 p53下游效應(yīng)分子［6］。毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)和脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE-1)也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)卡從而參與DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡過程［7－8］。

葉酸作為重要的B族維生素，參與調(diào)控與蛋白質(zhì)和DNA的合成、生物甲基化和基因表達(dá)等相關(guān)的一碳單位轉(zhuǎn)運［9］，在體內(nèi)的代謝受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1(DNA methyltransferase 1，DNMT-1)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(betaine homocysteine methyltransferase，BHMT)等的影響。葉酸缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞脫氧核苷酸庫不平衡、凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和p53等的表達(dá)出現(xiàn)異常，最終引起細(xì)胞DNA損傷、增殖減少、凋亡率增加和生長抑制;而補(bǔ)充葉酸可逆轉(zhuǎn)這些負(fù)面效應(yīng)［10］。大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸可增加肝細(xì)胞的再生能力，維持肝臟的正常形態(tài)和功能［11］。此外，葉酸可影響基因甲基化程度，從而改變基因的表達(dá)量［12］。生命早期機(jī)體的可塑性較強(qiáng)［13］，且出生后早期營養(yǎng)對于機(jī)體全期生長較為關(guān)鍵［1］，因此在這一階段實施營養(yǎng)干預(yù)可能改變機(jī)體已有的發(fā)育程序化。超早期斷奶后補(bǔ)充葉酸是否能在一定程度上緩解出生前環(huán)境對IUGR個體肝臟結(jié)構(gòu)和功能的影響尚有待進(jìn)一步的研究。因此，本試驗以自然發(fā)生IUGR的公仔豬為模型，考察超早期斷奶后補(bǔ)充不同水平的葉酸對仔豬肝臟結(jié)構(gòu)和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，為IUGR仔豬的養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，同時也為嬰兒營養(yǎng)臨床應(yīng)用提供思路。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取體況相近、產(chǎn)期接近的初產(chǎn)長白×約克夏母豬(配種采用同一頭大白公豬精液)所產(chǎn)初生體重為0.9～1.1 kg的33頭仔豬，體重低于該養(yǎng)殖廠仔豬平均出生體重的2倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為IUGR。14日齡斷奶時，選取其中24頭平均體重為(2.79±0.34)kg的仔豬隨機(jī)分為3個處理，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧中添加0、5和10 mg/kg葉酸的試驗飼糧，每個處理8個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期21 d。

1.2 試驗飼糧

妊娠期和哺乳期母豬飼喂相同飼糧。斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，飼糧營養(yǎng)水平參考美國NRC(1998)豬營養(yǎng)需要配制。在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0、5和10 mg/kg葉酸配制成試驗飼糧。葉酸純度≥98%，購于帝斯曼維生素(上海)有限公司。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬14日齡斷奶，單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼喂量以采食后料槽略有余料為準(zhǔn)。試驗期第1～14天室內(nèi)溫度控制在25～28℃，第15～21天室內(nèi)溫度為23～26℃。試驗第1天和結(jié)束后第1天08：00(空腹12 h以上)對試驗豬進(jìn)行稱重。

1.4 樣品收集與處理

1.4.1 血清樣品制備

試驗結(jié)束后第1天仔豬空腹稱重后，前腔靜脈采血10 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，分離血清，－20℃冰箱保存待測。

1.4.2 組織樣品的采集

采血后仔豬進(jìn)行麻醉，取出肝臟稱濕重后取部分組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈后，迅速放入4%中性福爾馬林固定液中固定，保存待制組織切片。另速取部分肝臟組織樣品于液氮中速凍，并及時將樣品放入－80℃中保存待測。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 血清葡萄糖和甘油三酯

血清葡萄糖濃度采用葡萄糖氧化酶－4－氨基安替比林(GOD-PAP)法測定，血清甘油三酯濃度采用甘油磷酸氧化酶－過氧化物酶－4－氨基安替比林和酚(GPO-PAP)法測定，均使用全自動生化分析儀(日立7020，日本)進(jìn)行，試劑盒購于四川邁克生物科技股份有限公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 肝細(xì)胞和肝小葉直徑

取置于4%中性福爾馬林固定液中的肝臟組織，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，再經(jīng)蘇木精－伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)，在顯微成像系統(tǒng)(尼康D70s，日本)下進(jìn)行觀察(目鏡10倍、物鏡40倍)，每個樣本選擇8～10個切片，每個切片選4～5個視野，測量肝細(xì)胞和肝小葉直徑。

1.5.3 肝臟凋亡相關(guān)和葉酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)量

實時定量PCR(real-time PCR)法測定肝臟Bcl-2、Bax、p53、ATM、APE-1、DNMT-1、BHMT、MTHFR的基因相對表達(dá)量。

肝臟組織總RNA提取按照試劑盒(Trizol Reagent，TaKaRa，日本)操作說明進(jìn)行，提取的總RNA溶解于無RNA酶水(RNase Free dH2O，TaKaRa，日本)中。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。核酸蛋白檢測儀(Beckman Du－800，CA，美國)于260 nm檢測RNA濃度。

cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMreagent kit，TaKaRa，日 本)。反 應(yīng) 體 系 10 μL：2 μL 5 × PrimeScriptTMBuffer，0.5 μL Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix，0.5 μL Oligo dT Primer，0.5 μL Random 6 mers，4.5 μL RNase Free dH2O，2 μL總RNA。反應(yīng)參數(shù)：37℃ 15 min;85℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用實時定量PCR儀(CFX－96 Real-Time PCR System，Bio-Rad，美國)進(jìn)行測定，反應(yīng)熒光染料為SYBR?GreenⅠ(TaKaRa，日本)。反應(yīng)體系 為 10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )，1 μL上游引物，1 μL 下游引物，2 μL 雙蒸水，1 μL cDNA模板。利用NCBI搜索目的基因片段，運用 Primer 5、Oligo 6.0進(jìn)行引物設(shè)計，由大連寶生物公司合成，引物序列見表2。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 s;95℃變性5 s，目的基因特異性退火溫度(表2)條件下退火25 s，40個循環(huán)。用于檢測基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的熔解曲線反應(yīng)程序為：95℃ 10 s;65℃ 25 s;95℃ 0 s(溫度變化速率為0.1℃/s)。表達(dá)量計算采用ΔΔCt和標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率校正法，參照 Pfaffl等［14］，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用10倍梯度稀釋法制作，每個樣品3個重復(fù)，試驗內(nèi)參基因選用β－肌動蛋白。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)，以 P＜0.01為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 葉酸對仔豬血清葡萄糖和甘油三酯濃度的影響

由表3可知，添加葉酸對35日齡仔豬血清葡萄糖濃度無顯著性影響(P＞0.05)，飼糧添加5和10 mg/kg葉酸血清葡萄糖濃度分別下降了5.38%和5.91%。血清甘油三酯受葉酸水平的影響較大，與0 mg/kg組相比，5和10 mg/kg組分別顯著(P ＜0.05)和極顯著(P ＜0.01)地降低。

表2 實時定量PCR引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time PCR

表3 葉酸添加水平對35日齡仔豬血清葡萄糖和甘油三酯濃度的影響Table 3 Effects of folic acid supplemental level on concentrations of glucose and TG in serum of piglets at 35 days of age mmol/L

2.2 葉酸對仔豬肝臟結(jié)構(gòu)的影響

由圖1和表4可知，0 mg/kg組肝細(xì)胞直徑最大;與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組肝細(xì)胞直徑顯著減小(P＜0.05);10 mg/kg組肝細(xì)胞直徑與其余2組相比無顯著性差異(P＞0.05)。添加葉酸對肝小葉直徑無顯著性影響(P＞0.05)，但飼糧添加5和10 mg/kg葉酸使仔豬肝小葉直徑分別下降了 5.78%和 7.57%。

2.3 葉酸對肝臟凋亡相關(guān)和葉酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表5可知，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組Bcl-2的基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，Bax和p53的基因表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01);10 mg/kg組Bcl-2的基因表達(dá)量與其他2組無顯著差異(P＞0.05)，而Bax和p53的基因表達(dá)量分別極顯著(P ＜0.01)和顯著(P ＜0.05)地降低了，但與5 mg/kg組無顯著差異(P＞0.05)。

表4 葉酸添加水平對35日齡仔豬肝臟結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effects of folic acid supplemental level on liver structure of piglets at 35 days of age μm

添加葉酸對ATM和APE-1的基因表達(dá)無顯著影響(P ＞0.05);與0 mg/kg組相比，5 mg/kg組ATM和APE-1的基因表達(dá)量分別降低了11%和21%。葉酸和蛋氨酸循環(huán)的關(guān)鍵酶編碼基因DNMT-1、BHMT和MTHFR的表達(dá)量未受飼糧葉酸水平的顯著影響(P＞0.05)。

表5 葉酸添加水平對35日齡仔豬肝臟凋亡相關(guān)和葉酸代謝相關(guān)基因相對表達(dá)的影響Table 5 Effects of folic acid supplemental level on the relative expression level of apoptosis-related and folic acid metabolism-related genes in the liver of piglets at 35 days of age

3 討論

IUGR可導(dǎo)致新生兒高死亡率和畸形率，并影響機(jī)體組成和長期健康，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，目前對于IUGR的研究主要集中在IUGR的危害及預(yù)防措施上［15］，通過營養(yǎng)干預(yù)和飼養(yǎng)管理改善IUGR個體的存活和健康方面仍少有報道。IUGR對器官結(jié)構(gòu)和功能、機(jī)體生理代謝的深遠(yuǎn)影響提示IUGR個體通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控著相關(guān)基因的表達(dá)［16］。機(jī)體在出生后早期細(xì)胞大量增殖、生長迅速［17］，同時擁有較強(qiáng)的發(fā)育可塑性［13］，葉酸作為一碳單位載體，其在體內(nèi)的代謝與核酸合成、蛋白質(zhì)代謝和生物甲基化等過程密切相關(guān)［9］。因此本試驗以IUGR仔豬為模型，研究在出生后早期飼糧中添加葉酸對肝臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。

Burdge等［5］在大鼠上的研究表明，對蛋白質(zhì)不足母大鼠后代，28日齡斷奶后飼糧添加5 mg/kg葉酸對血清葡萄糖和甘油三酯濃度無顯著影響，而妊娠期母大鼠飼糧補(bǔ)充5 mg/kg葉酸則可顯著降低后代血清葡萄糖和甘油三酯濃度［18］。本試驗結(jié)果表明，IUGR仔豬超早期斷奶后飼糧添加5和10 mg/kg葉酸對血清葡萄糖水平無顯著影響，但分別顯著和極顯著降低了血清甘油三酯濃度。結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能與實施營養(yǎng)干預(yù)時機(jī)體所處狀態(tài)、模型動物自身生理狀態(tài)和葉酸處理時間長短的差異有關(guān)。

本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧添加5和10 mg/kg葉酸有降低肝小葉直徑的趨勢，且5 mg/kg組顯著降低了肝細(xì)胞直徑，而10 mg/kg組肝細(xì)胞直徑無顯著變化，提示添加5 mg/kg葉酸能夠促進(jìn)肝細(xì)胞數(shù)量的增加，而10 mg/kg葉酸有減少肝細(xì)胞數(shù)量的趨勢。提示出生后早期飼糧添加5 mg/kg葉酸有利于肝細(xì)胞的增殖，而10 mg/kg葉酸對肝細(xì)胞增殖無正面效應(yīng)。Roncales等［11］也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸可以改善大鼠肝細(xì)胞的再生能力，增加肝細(xì)胞核密度和肝細(xì)胞數(shù)目，維持肝臟的正常形態(tài)。IUGR仔豬生長緩慢，超早期斷奶后肝臟細(xì)胞數(shù)量可能仍在變化。那么肝細(xì)胞數(shù)量的差異是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)呢?

Bcl-2和Bax是Bcl家族中研究最為廣泛的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，通過信號途徑激活細(xì)胞半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶－3(caspase-3)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程中的染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂。Bcl-2參與細(xì)胞凋亡抑制過程，緩解Bax的促凋亡效應(yīng)，對正常細(xì)胞起保護(hù)作用［19］。p53是凋亡過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，是凋亡級聯(lián)途徑的有效元件，也是一個轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，p53低水平表達(dá)，且蛋白質(zhì)周期較短。應(yīng)激、缺氧和DNA受損時，細(xì)胞核中p53出現(xiàn)蓄積，并作為轉(zhuǎn)錄因子被激活，負(fù)調(diào)控 Bcl-2的表達(dá)，與 Bax的表達(dá)呈正相關(guān)［6，20］。正常生理條件下，一方面，APE-1 可抑制氧化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞免遭凋亡;另一方面，APE-1可通過氧化還原與非氧化還原的方式活化p53，從而促進(jìn)p53靶基因Bax等的轉(zhuǎn)錄活化［8］。DNA損失可激活A(yù)TM，后者通過磷酸化反應(yīng)激活DNA修復(fù)相關(guān)蛋白、損失應(yīng)激蛋白及p53等，以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞修復(fù)或細(xì)胞周期抑制［7］。葉酸參與了DNA前體物質(zhì)嘌呤、嘧啶的形成，與DNA復(fù)制、修復(fù)和穩(wěn)定性相關(guān)。有研究表明，葉酸缺乏會導(dǎo)致機(jī)體或細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞增殖減少、凋亡增加［21］。本實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn)，母體補(bǔ)充葉酸可以緩解IUGR仔豬Bcl-2、Bax和p53的基因表達(dá)發(fā)生變化［4，22］。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 mg/kg葉酸顯著增加了Bcl-2的基因表達(dá)，降低了Bax和p53的基因表達(dá)，而ATM和APE-1的基因表達(dá)呈下降的趨勢;添加10 mg/kg葉酸并未進(jìn)一步改善肝臟結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，長期過量補(bǔ)充葉酸可能損傷機(jī)體神經(jīng)功能、免疫功能和蛋白質(zhì)代謝，并與一些癌癥的發(fā)生有關(guān)，機(jī)體的葉酸代謝相關(guān)生化指標(biāo)與葉酸缺乏時類似［23－25］。迄今為止，關(guān)于葉酸過量產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)的具體機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

DNMT-1是DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其表達(dá)直接影響DNA甲基化狀態(tài)。在葉酸介導(dǎo)的一碳單位代謝中，BHMT利用甜菜堿催化同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，與蛋氨酸合酶(methionine synthasse，MS)的作用一致;MTHFR調(diào)控5－甲基四氫葉酸的形成，而后者是葉酸的活化形式，被MS利用從而促進(jìn)同型半胱氨酸的再甲基化。本試驗中，肝臟 DNMT-1、BHMT和MTHFR的基因表達(dá)量未受葉酸水平的顯著影響，而細(xì)胞凋亡相關(guān)基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，這可能與甲基化的基因特異性有關(guān)。Engeham等［26］的研究也表明母體補(bǔ)充葉酸時，DNMT-1、MTHFR和MS的基因表達(dá)未受影響。葉酸介導(dǎo)的一碳單位代謝是一個復(fù)雜的相互作用的系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)大范圍的調(diào)節(jié)機(jī)制使機(jī)體整體的葉酸和蛋氨酸循環(huán)處于穩(wěn)態(tài)。過多葉酸會與葉酸結(jié)合蛋白結(jié)合，這些葉酸結(jié)合蛋白是葉酸循環(huán)過程中的催化酶，具有變構(gòu)效應(yīng)，葉酸的結(jié)合使變構(gòu)酶的反應(yīng)速率下降;過量葉酸可導(dǎo)致5－甲基四氫葉酸蓄積。有研究指出過量5－甲基四氫葉酸(5-MTHF)會向胞外轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致胞內(nèi)葉酸庫容量下降，即葉酸過量的效應(yīng)與葉酸缺乏癥狀相似。當(dāng)5-MTHF利用減少時，肝臟動用BHMT途徑以緩解該效應(yīng)［26－28］。

4 結(jié)論

①飼糧補(bǔ)充一定水平的葉酸有助于改善超早期斷奶IUGR仔豬35日齡時肝臟結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和p53的表達(dá)。

②本試驗條件下，飼糧添加5 mg/kg葉酸效果較好。

［1］DESAI M，CROWTHER N J，LUCAS A，et al.Organ-selective growth in the offspring of protein-restricted mothers［J］.British Journal of Nutrition，1996，76(4)：591 －603.

［2］MORTENSEN O H，OLSEN H L，F(xiàn)RANDSEN L，et al.Gestational protein restriction in mice has pronounced effects on gene expression in newborn offspring’s liver and skeletal muscle：protective effect of taurine［J］.Pediatric Research，2009，67(1)：47 －53.

［3］BUFFAT C，BOUBRED F，MONDON F，et al.Kidney gene expression analysis in a rat model of intrauterine growth restriction reveals massive alterations of coagulation genes［J］.Endocrinology，2007，148(11)：5549 －5557.

［4］劉靜波，姚英，余冰，等.葉酸對初產(chǎn)母豬繁殖性能和宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬腎臟功能基因表達(dá)的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，22(2)：278 －284.

［5］BURDGE G C，LILLYCROP K A，PHILLIPS E S，et al.Folic acid supplementation during the juvenilepubertal period in rats modifies the phenotype and epigenotype induced by prenatal nutrition［J］.The Journal of Nutrition，2009，139(6)：1054 －1060.

［6］BASERGA M，HALE M A，MCKNIGHT R A，etal.Uteroplacental insufficiency alters hepatic expression，phosphorylation，and activity of the glucocorticoid receptor in fetal IUGR rats［J］.The American Journal of Physiology，2005，289(5)：1348 －1353.

［7］CORTEZ D，WANG Y，QIN J，et al.Requirement of ATM-dependent phosphorylation of brca1 in the DNA damage response to double-strand breaks［J］.Science，1999，286：1162 －1166.

［8］湯顯斌，譚云山.脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2003，30：249 －251.

［9］BAILEY L B，GREGORY J F.Folate metabolism and requirements［J］. The Journal of Nutrition，1999，129(4)：779 －782.

［10］HUANG R F S，HO Y H，LIN H L，et al.Folate deficiency induces a cell cycle-specific apoptosis in HepG2 cells［J］.The Journal of Nutrition，1999，129(1)：25 －31.

［11］RONCALES M，ACHON M，MANZARBEITIA F，et al.Folic acid supplementation for 4 weeks affects liver morphology in aged rats［J］.The Journal of Nutrition，2004，134(5)：1130 －1133.

［12］KOTSOPOULOS J，SOHN K J，KIM Y I.Postweaning dietary folate deficiency provided through childhood to puberty permanently increases genomic DNA methylation in adult rat liver［J］.The Journal of Nutrition，2008，138(4)：703 －709.

［13］GODFREY K M，GLUCKMAN P D，HANSON M A.Developmental origins of metabolic disease：life course and intergenerational perspectives［J］.Trends in Endocrinology＆Metabolism，2010，21(4)：199－205.

［14］PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］.Nucleic Acids Research，2001，29(9)：e45.

［15］孔祥峰，吳國耀，印遇龍.豬宮內(nèi)發(fā)育遲緩及其防治研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009(10)：96 －101.

［16］PINNEY S E，SIMMONS R A.Epigenetic mechanisms in the development of type 2 diabetes［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，2009，21(4)：223 －229.

［17］WHITTEMORE C T，TULLIS J B，EMMANS G C.Protein growth in pigs［J］. Animal Production，1988，46(3)：437 －445.

［18］BURDGE G C，LILLYCROP K A，JACKSON A A，et al.The nature of the growth pattern and of the metabolic response to fasting in the rat are dependent upon the dietary protein and folic acid intakes of their pregnant dams and post-weaning fat consumption［J］.British Journal of Nutrition，2008，99(3)：540 －549.

［19］KORSMEYER S J，SHUTTER J R，VEIS D J，et al.Bcl-2/Bax：a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death［J］.Seminars in Cancer Biology，1993，4(6)：327 －332.

［20］PHAM T D，MACLENNAN N K，CHIU C T，et al.Uteroplacental insufficiency increases apoptosis and alters p53 gene methylation in the full-term IUGR rat kidney［J］.American Journal of Physiology，2003，285(5)：962 －970.

［21］BAGNYUKOVA T V，POWELL C L，PAVLIV O，et al.Induction of oxidative stress and DNA damage in rat brain by a folate/methyl-deficient diet［J］.Brain Research，2008，1237：44 －51.

［22］LIU J，CHEN D，MAO X，et al.Effects of maternal folic acid supplementation on morphology and apoptosis-related gene expression in jejunum of newborn intrauterine growth retarded piglets［J］.Archives of Animal Nutrition，2011，65(5)：376 －385.

［23］ACHON M，REYES L，ALONSO-APERTE E，et al.High dietary folate supplementation affects gestational development and dietary protein utilization in rats［J］.The Journal of Nutrition，1999，129(6)：1204－1208.

［24］CARNEY E，CANADA T.Dietary folate and vitamin B12 intake and cognitive decline among community-dwelling older persons［J］.Nutrition in Clinical Practice，2006，21(2)：188 －189.

［25］ULRICH C M，POTTER J D.Folate supplementation：too much of a good thing?［J］Cancer Epidemiology Biomarkers＆Prevention，2006，15(2)：189－193.

［26］ENGEHAM S F，HAASE A，LANGLEY-EVANS S C.Supplementation of a maternal low-protein diet in rat pregnancy with folic acid ameliorates programming effects upon feeding behaviour in the absence of disturbances to the methionine-homocysteine cycle［J］.British Journal of Nutrition，2010，103(7)：996 －1007.

［27］REED M C，NIJHOUT H F，NEUHOUSER M L，et al.A mathematical model gives insights into nutritional and genetic aspects of folate-mediated one-carbon metabolism［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(10)：2653 －2661.

［28］NIJHOUT H F，REED M C，BUDU P，et al.A mathematical model of the folate Cycle［J］.Journal of Biological Chemistry，2004，279(53)：55008 －55016.

［29］ULRICH C M，REED M C，NIJHOUT H F.Modeling folate，one-carbon metabolism，and DNA methylation［J］.Nutrition Reviews，2008，66：27 －30.