馮海英 孫海波 韓云峰

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院骨外三科，黑龍江齊齊哈爾 161006

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)通常需要端粒酶的存在，其是目前發(fā)現(xiàn)的廣譜腫瘤標(biāo)志。有研究報(bào)道，多數(shù)肺癌細(xì)胞中均有端粒酶的激活。端粒酶是核糖核蛋白復(fù)合物，由蛋白質(zhì)和RNA組成，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性[1-2]。腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞主要為癌細(xì)胞永生化，研究表明，激活端粒酶基因與腫瘤細(xì)胞永生化存在密切關(guān)系[3]。關(guān)于多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)肺癌患者端粒酶在肺癌中的臨床意義，目前還沒(méi)有報(bào)道。本研究分析了2009年1月～2010年12月期間我院收治的經(jīng)確診為肺癌合并胸水患者36例誘導(dǎo)痰、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織的端粒酶活性，探討端粒酶作為肺癌診斷標(biāo)志物的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2010年12月間我院收治的經(jīng)確診為肺癌合并胸水的患者36例的臨床資料作為研究組，所有患者經(jīng)纖維支氣管鏡檢查，發(fā)現(xiàn)病變肺組織后鉗取3～5塊組織，離體后30 min內(nèi)放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?biāo)本進(jìn)行病理學(xué)及組織細(xì)胞學(xué)檢查，明確診斷為肺癌。36例患者中，男25 例，女 12 例；年齡 31～80 歲，平均（62.3±19.4）歲；主要臨床表現(xiàn)：咳嗽28例，咯血26例，聲音嘶啞10例，胸痛14例，發(fā)熱21例，胸悶氣短15例；病理分型：鱗癌19例（52.8%），小細(xì)胞癌4例（11.1%），腺癌10例（27.8%），未定型癌（腺鱗癌、復(fù)合性癌）3例（8.3%）。另選擇35例同期經(jīng)確診肺部良性病變伴胸水患者作為對(duì)照組，其中，男24例，女11例；年齡 32～79 歲，平均（61.5±18.2）歲。兩組年齡、性別等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶購(gòu)自天象人生物工程公司，批號(hào)：02045674；AgNO3為北京化工廠產(chǎn)品，批號(hào)：111026；考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自南京建成生物工程公司，批號(hào)：20110912；端粒酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自O(shè)nco Inc公司，批號(hào)：1104101。所有實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按藥盒說(shuō)明書操作。

1.2.2 誘導(dǎo)痰的采集 收集患者痰液3～5 mL放入無(wú)菌杯中，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩遍，加入等量的1 moL/L NaOH溶液，放入4℃冰箱24 h，取溶解痰液高速離心，將沉淀細(xì)胞放入-80℃冰箱備用。檢測(cè)時(shí)，將冷凍的標(biāo)本解凍后放入200μL的端粒酶裂解液中離心，移取上清液放入EP管中待測(cè)[4]。

表1 兩組患者各指標(biāo)端粒酶活性比較（x±s）

1.2.3 胸水細(xì)胞提取液的采集 各組患者胸腔穿刺術(shù)抽取新鮮胸水100 mL，高速離心，棄上清，離心細(xì)胞置液氮中保存（-196℃）。檢測(cè)時(shí)，將冷凍的標(biāo)本解凍后放入200μL的端粒酶裂解液中離心后移取上清液放入EP管中待測(cè)。

1.2.4 患者血細(xì)胞制備 抽取外周血5 mL，用肝素抗凝，血樣經(jīng)Ficoll分離液離心后，收集界面細(xì)胞，生理鹽水洗滌1次，放入0.2 mL PBS中，將標(biāo)本放在-20℃冰箱中保存[5]。

1.2.5 支氣管灌洗液收集 氣管鏡頂端插入肺段或亞段支氣管開口處，從活檢孔用無(wú)菌生理鹽水100 mL分5次注入，每次注入后立即在6.5～25.5 kPa的負(fù)壓下吸出，回收液量40%～60%；雙層紗布過(guò)濾后，離心放-80℃冰箱凍存[6]。

1.2.6 肺組織采集 采用電子纖維支氣管鏡活檢患者時(shí)取肺組織，用PBS液沖洗后，液氮速凍放在-80℃保存。檢測(cè)時(shí)取冰凍組織，剪碎，放入100μL細(xì)胞裂解液，水浴30 min，高速離心，收集上清液，放在-80℃冰箱中保存[7]。

1.2.7 TRAP-ELISA法測(cè)定端粒酶活性 取各種標(biāo)本的細(xì)胞[（1×105）～（1×106）]加 150 μL 裂解液抽提端粒酶，離心后取上清2μL做反應(yīng)模板；取TRAP反應(yīng)管，各加入45μL反應(yīng)混合物行端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增 （TRAP），并與已處理的標(biāo)本2 μL混勻，加入30μL液體石蠟，離心后置25℃水浴保存30 min，取出即行 PCR 循環(huán)擴(kuò)增：94℃ 30 s，55℃ 30 s；共行 35個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm/690 nm，端粒酶活性為△A=A450-A690。敏感性（陽(yáng)性率）=測(cè)定指標(biāo)的陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)。準(zhǔn)確性=（真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù)）/研究總例數(shù)。特異性=對(duì)照組測(cè)定指標(biāo)的陰性例數(shù)/對(duì)照組的總例數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者各指標(biāo)端粒酶活性的比較

研究表明，與對(duì)照組患者比較，研究組患者誘導(dǎo)痰性、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶活性明顯增高，兩組患者比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見表 1。

2.2 多項(xiàng)指標(biāo)端粒酶活性檢測(cè)診斷肺癌的特異性、敏感性及準(zhǔn)確性比較

5種標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果判斷：5種標(biāo)本檢測(cè)均為陰性即判斷為陰性，其中，有1種以上檢測(cè)為陽(yáng)性即判斷為陽(yáng)性。標(biāo)本單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)敏感性、特異性和準(zhǔn)確性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。五種標(biāo)本中端粒酶活性聯(lián)合及單獨(dú)檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性情況見表2。

表2 多項(xiàng)指標(biāo)端粒酶活性檢測(cè)診斷肺癌的特異性、敏活性及準(zhǔn)確性比較[%（n1/n2）]

3 討論

端粒是染色體末端存在的獨(dú)特重復(fù)片段特殊結(jié)構(gòu)，在染色體定位、染色體保護(hù)、染色體復(fù)制控制細(xì)胞的生長(zhǎng)方面起著控制的作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂時(shí)，端粒片段出現(xiàn)縮短，促使細(xì)胞凋亡和導(dǎo)致程序性死亡[8]。端粒的長(zhǎng)度又被稱為是“有絲分裂鐘”，而端粒酶作為一種逆轉(zhuǎn)錄酶可以用自身RNA為模板，在端粒DNA的3'末端，以逆轉(zhuǎn)錄方式延伸，修補(bǔ)細(xì)胞分裂時(shí)端粒的縮短，穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度，導(dǎo)致細(xì)胞永生化，不斷增殖和不死亡[9-10]，從而導(dǎo)致惡性變，所以端粒酶可以作為較廣譜的腫瘤標(biāo)志物。

本研究表明，與對(duì)照組患者比較，研究組患者誘導(dǎo)痰、外周血、胸水、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶活性明顯增高，兩組患者相對(duì)應(yīng)指標(biāo)比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在肺癌患者中，各類標(biāo)本均顯示端粒酶高表達(dá)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的抑制，導(dǎo)致那些具有顯著基因改變、脫離細(xì)胞周期、已失去端粒保護(hù)的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，因此，端粒酶活性檢測(cè)可用于肺癌的診斷，是臨床診斷手段的重要補(bǔ)充，有助于提高肺癌診斷的靈敏度及準(zhǔn)確性[11]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合5種標(biāo)本中端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性與單獨(dú)檢測(cè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合檢測(cè)誘導(dǎo)痰、胸水、外周血、支氣管沖洗液、纖維支氣管鏡活檢組織端粒酶活性對(duì)肺癌的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均較單項(xiàng)檢測(cè)大大提高，特別是對(duì)肺癌伴胸水患者聯(lián)合檢測(cè)的早期診斷有重要意義。

綜上所述，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)端粒酶活性診斷肺癌敏感性高，特異性強(qiáng)，提高了診斷準(zhǔn)確率。作為腫瘤標(biāo)志物的端粒酶，在篩選肺癌高危人群、定期監(jiān)測(cè)中可能具有重要臨床指導(dǎo)意義。

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