李 惠 鄒立華 陳小丹 謝麗華

廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸科，廣東深圳 518172

支氣管哮喘是一種常見病，是各類炎癥細胞及其分泌的細胞因子、炎癥介質(zhì)共同作用的結(jié)果，酪氨酸激酶信號傳導途徑在此起重要作用[1]。吸入糖皮質(zhì)激素對于減輕哮喘癥狀及氣道炎癥是十分有效的，但其作用機制尚未完全明了。本研究旨在觀察布地奈德（Budesonide，BUD）對哮喘小鼠酪氨酸激酶信號傳導途徑中JAK1及白細胞介素-4（interleukin 4，IL-4）表達的影響，希望從分子水平探討糖皮質(zhì)激素的作用機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

布地奈德購自阿斯利康公司，抗JAK1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，雞卵白蛋白（OVA，Sigma），IL-4 及 IgE 試劑盒購自深圳晶美生物制品公司，其余試劑均為市售分析純試劑。健康雄性小鼠30只（廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供，清潔級），6～8 周齡，體重 20～25 g，隨機分成 3 組，每組 10 只，按報道的方法復制及處死模型[2]：①對照組（A組）：抗原混合液為氫氧化鋁和生理鹽水。②哮喘模型組（B組）：抗原混合液為氫氧化鋁和OVA。③布地奈德干預組（C組）：激發(fā)時加用BUD混懸液霧化吸入，吸入時間與激發(fā)時間相等。

1.2 方法

1.2.1 EOS及Ig E檢測 用磷酸鹽緩沖液1 mL灌洗雙肺1次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），行嗜酸性粒細胞（EOS）計數(shù)，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定IgE水平。

1.2.2 肺組織勻漿IL-4測定 取0.1 g肺組織解凍后，勻漿，離心取上清液，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-4。

1.2.3 肺組織蛋白質(zhì)酪氨酸蛋白激酶JAK1表達的檢測 肺組織解凍后取0.1 g放入含蛋白抽提液的勻漿器中，置于冰上勻漿后，放置 30 min，4℃下 12 000 r/min離心 5 min；取上清液，測定蛋白質(zhì)含量。參照羅卿等[3]方法測定JAK1的表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組樣本間兩兩比較用q檢驗，各指標間行直線相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀觀察

激發(fā)約10 min 后B組小鼠開始出現(xiàn)鼻煽、呼吸加快加深、大小便失禁、抽搐等，提示引喘成功。A組未見哮喘癥狀。C組小鼠霧化吸入布地奈德后的前3天出現(xiàn)鼻煽、呼吸加快加深，偶有抽搐現(xiàn)象，第4天開始這些癥狀明顯減少，只有一只小鼠在第4天出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象。

2.2 小鼠BALF中EOS計數(shù)及IgE水平

B組EOS計數(shù)及IgE水平均較A組高 （均P＜0.01），C組EOS計數(shù)及IgE水平均較B組低（均P＜0.05）。見表1。

表1 小鼠BALF中IgE水平及嗜酸性粒細胞計數(shù)（x±s）

2.3 肺組織IL-4、JAK1的表達及相關(guān)性

B組小鼠IL-4及JAK1表達均較A組高（均P＜0.01）；C組小鼠IL-4及JAK1表達均較B組低（均P＜0.05），見表2。相關(guān)性分析顯示，JAK1的表達與IL-4的濃度呈正相關(guān)（r=0.724，P ＜ 0.01）。

表2 各組肺組織IL-4、JAK1的表達（x±s）

3 討論

支氣管哮喘是慢性氣道炎癥性疾病，氣道反應性增加，其中一個重要特征是存在激活的Th2淋巴細胞、EOS和肥大細胞[4]。這種Th2細胞在合成IgE時激活結(jié)合IgE的細胞。IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子，不僅促進Th2細胞的分化，同時抑制Th1細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠IL-4濃度及IgE含量、EOS計數(shù)升高，說明它們參與哮喘的氣道炎癥，與相關(guān)報道[5]一致。

JAK（Janus kinase）是一類非受體型蛋白酪氨酸激酶，位于胞漿中，其家族成員有JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。部分生長因子、白細胞介素、干擾素等細胞因子與其受體結(jié)合后，激活了與受體關(guān)聯(lián)的JAKs家族，從而促使相應的信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激動子 （signal transductors and activator of transcription，STAT）磷酸化后轉(zhuǎn)移到細胞核，與GAS增強子家族成員結(jié)合，完成相關(guān)基因的表達。JAKs-STAT途徑最先在干擾素信號傳遞研究中發(fā)現(xiàn)，隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)該途徑還參與了哮喘發(fā)病機制中許多細胞因子的信號轉(zhuǎn)導[6]。IL-4、IL-13、IL-5等是參與哮喘發(fā)作的重要的細胞因子[7-9]。本研究中哮喘小鼠IL-4的表達明顯升高，且與JAK1濃度呈正相關(guān)。表明IL-4和JAKs-STAT途徑與哮喘密切相關(guān)。

吸入性糖皮質(zhì)激素是當前防治哮喘的一線藥物。布地奈德是新合成的表面皮質(zhì)激素，較地塞米松具有更高的親脂性，易穿過細胞膜與細胞漿內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，局部抗炎活性強于地塞米松幾百倍[10]。國內(nèi)研究結(jié)果提示BUD可能通過下調(diào)JAK1和STAT6的表達，從而抑制了依賴于JAK1／STAT6通路的氣道重塑[11]。本研究結(jié)果顯示BUD干預組小鼠哮喘癥狀緩解，小鼠BALF中IgE含量及EOS計數(shù)較哮喘模型組減少，肺組織中IL-4、JAK1的表達低于哮喘模型組，說明BUD能有效控制哮喘癥狀，減輕氣道炎癥，可能與抑制IL-4的水平、下調(diào)JAK1的表達，進而抑制Th0向Th2細胞的分化增殖有關(guān)。

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