俞 艷，劉曉靜，齊敏興，張曉磊，付 萍，王巧玲，張曉玲，李鴻燕

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）素有“牧草之王”的美稱，是一種蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)質(zhì)豆科牧草。在其生長(zhǎng)過(guò)程中受到多種因素的影響，土壤pH是主要的因素之一。苜蓿在我國(guó)主要分布于北方中性和微酸性土壤中，但其適宜的土壤pH為6.5～7.5。紫花苜蓿接種根瘤菌可以提高其產(chǎn)量和品質(zhì)［1］，但苜蓿根瘤菌一般不耐酸，酸性土壤降低了根瘤菌與宿主植物之間的親和性，抑制了根瘤菌的存活，致使豆科牧草生物固氮受阻［2，3］，同時(shí)土壤pH 影響紫花苜蓿根系鐵離子的吸收［4］。氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分［5］，對(duì)植物的生命活動(dòng)以及產(chǎn)量的形成與品質(zhì)的優(yōu)劣均有著極為重要的作用［6］。施氮對(duì)紫花苜蓿的早期生長(zhǎng)具有積極意義［7］。硝態(tài)氮與銨態(tài)氮均能被植物吸收，但不同形態(tài)的氮素對(duì)植物生理特性和生長(zhǎng)發(fā)育的影響不同［8］。為進(jìn)一步探討pH和不同氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根瘤特性的影響，采用砂培方法，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液控制pH梯度和氮素形態(tài)，排除其他外部環(huán)境的影響，更加客觀直接的反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果，以期為紫花苜蓿最適的pH范圍和氮素供應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試品種

供試苜蓿品種為甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿（Medicago sativavar.Gannong No.3），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。選取大小均勻，顆粒飽滿種子，先用95%乙醇浸泡5min，再用0.1%HgCl2溶液滅菌6～10min，然后無(wú)菌水沖洗5～6次。

1.2 供試根瘤菌菌株

中華根瘤菌（12531），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。將菌株進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，挑起單菌落接種于YMA培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用無(wú)菌水洗下根瘤菌體，裝入無(wú)菌三角瓶中。

1.3 營(yíng)養(yǎng)液配制

Fahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液配制方法：Na2HPO4·12H2O 0.15g，MgSO4·7H2O 0.12g，檸檬酸鐵0.005g，CaCl2·2H2O 0.1g，KH2PO40.1g，Gibson微量元素1mLH2O 1 000mLGibson微量元素液：H3BO32.86g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CuSO4·5H2O 0.08g，MnSO4·4H2O 2.03g，Na2MoO4·2H2O 1.26g，H2O 1 000mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用砂培方法，選用直徑7.0cm、高8.5cm的塑料杯，裝入高溫滅菌的粗砂230g。每杯播種10粒已消毒的種子，覆蓋干沙50g。pH設(shè)5、6、7、8、9共5個(gè)梯度；設(shè)氮素形態(tài)為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮2種，以Fahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液為基本營(yíng)養(yǎng)液，分別以Ca（NO3）2和（NH4）2SO4為氮源配制所需營(yíng)養(yǎng)液，用HCl和NaOH溶液把營(yíng)養(yǎng)液pH分別調(diào)成5、6、7、8、9，一次性施入。待種子發(fā)芽時(shí)，每個(gè)塑料杯接種新培養(yǎng)的苜蓿根瘤菌液2mL。每6個(gè)塑料杯為1個(gè)重復(fù)，放入水培盒中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)排列。營(yíng)養(yǎng)液每水培盒500mL，使液面保持一致，并標(biāo)出液面線。實(shí)驗(yàn)均在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，期間每隔4d補(bǔ)充1次蒸餾水，處理60d后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

根瘤數(shù) 數(shù)每個(gè)植株的根瘤總數(shù)；根瘤重 將摘下的根瘤在電子天平上稱鮮重；固氮酶活性 采用乙炔還原法測(cè)定［9，10］。稱取0.2g的新鮮根瘤置于7mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出0.7mL空氣，注入0.7mL乙炔，室溫下反應(yīng)30min，待機(jī)器穩(wěn)定，用微量注射器抽取混合氣體25μL注入氣相色譜儀（GC）進(jìn)樣柱中，測(cè)定C2H2、C2H4峰值。然后，在同樣條件下用標(biāo)準(zhǔn)乙烯測(cè)定并繪制乙烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計(jì)算根瘤樣品的固氮酶活性。每個(gè)處理3次重復(fù)。測(cè)定儀器為GC－7890F氣相色譜儀，柱溫180℃，進(jìn)樣器150℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器170℃。氣體壓力N2為0.3mPa，H2為0.08mPa，空氣為0.15mPa。

C2H4水平［μmol/（g·h）］＝hx（樣品峰面積）×C（標(biāo)準(zhǔn) C2H4水平，μmol/mL）×V（培養(yǎng)容器體積，mL）/hs（標(biāo)準(zhǔn) C2H4峰面積）×24.9×t（C2H2反應(yīng)時(shí)間，h）×m（瘤重，g）。

植株根系全氮含量 植株的全氮含量采用濃H2SO4－H2O2法測(cè)定［11］。

地上、地下生物量 采用105～110℃殺青30min，70～80℃烘至恒重，稱重。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析（one－way ANOVA）和新復(fù)極差法（Duncan法）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根瘤數(shù)的影響

根瘤數(shù)的多少可以直接反映根瘤菌固氮效率的強(qiáng)弱，結(jié)果表明（圖1），在其他營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)充分的條件下，pH和不同氮素形態(tài)均對(duì)紫花苜蓿根瘤數(shù)目有顯著影響。在給定的pH范圍，對(duì)于不同氮素形態(tài)處理的紫花苜蓿，均以pH為7時(shí)根瘤數(shù)最多，過(guò)高或過(guò)低的pH對(duì)結(jié)瘤的形成均存在抑制作用。同時(shí)，氮素形態(tài)的不同也直接影響紫花苜蓿根瘤的形成，銨態(tài)氮培養(yǎng)下的根瘤數(shù)顯著大于硝態(tài)氮培養(yǎng)。表明中性pH和銨態(tài)氮更有利于紫花苜蓿根瘤的生長(zhǎng)與形成。此結(jié)果與嚴(yán)君［12］在大豆上的施氮效果一致。

圖1 pH和氮素形態(tài)下的紫花苜蓿根瘤數(shù)Fig.1 Effect of pH value and nitrogen forms on root nodule number of alfalfa

2.2 pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根瘤重的影響

pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根瘤重具有顯著影響（圖2）。在給定的pH梯度下，不同氮素形態(tài)處理的紫花苜蓿，pH均為7時(shí)根瘤重達(dá)到最大值，低pH和高pH對(duì)根瘤重的增大均具有抑制作用。同時(shí)，銨態(tài)氮培養(yǎng)下的根瘤重顯著大于硝態(tài)氮。

圖2 pH和氮素形態(tài)下的紫花苜蓿根瘤重Fig.2 Effect of pH value and nitrogen forms on nodulation of alfalfa

2.3 pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿固氮酶活性的影響

銨態(tài)氮培養(yǎng)下紫花苜蓿的固氮酶活性要顯著高于硝態(tài)氮培養(yǎng)（圖3），說(shuō)明銨態(tài)氮更有利于紫花苜蓿固氮酶活性的提高。同時(shí)，在給定的pH范圍內(nèi)，在pH為7時(shí)，2種不同氮素形態(tài)培養(yǎng)下紫花苜蓿的固氮酶活性都最高。pH＝5和pH＝9時(shí)，固氮酶活性最低，說(shuō)明偏酸和偏堿的環(huán)境對(duì)固氮酶活性均有抑制作用。而處理在pH＝6時(shí)的固氮酶活性強(qiáng)于pH＝8時(shí)的固氮酶活性，說(shuō)明偏酸的環(huán)境下固氮酶活性比偏堿環(huán)境下更高，表明甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿對(duì)偏酸環(huán)境具有一定的耐受性。

圖3 pH和氮素形態(tài)下的紫花苜蓿固氮酶活性Fig.3 Effect of pH value and nitrogen forms on nitrogenaseactivity of alfalfa

2.4 pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根系全氮含量的影響

pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿根系全氮含量具有顯著影響。在5個(gè)pH處理中，pH為7時(shí)根系全氮含量最高，pH為5時(shí)最低（圖4）。同時(shí)，堿性處理下的根系全氮含量要顯著高于酸性處理，說(shuō)明這個(gè)處理對(duì)偏堿性環(huán)境有一定的耐受性，這可能與根瘤菌產(chǎn)酸的生理特性有關(guān)，由于根瘤菌在共生固氮過(guò)程中分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生酸，降低了根際周圍的pH。從氮素形態(tài)對(duì)其影響來(lái)看，銨態(tài)氮培養(yǎng)下紫花苜蓿根系全氮含量要顯著高于硝態(tài)氮培養(yǎng)，說(shuō)明銨態(tài)氮更有利于紫花苜蓿固氮酶活性的提高。

2.5 pH和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿地上、地下生物量的影響

對(duì)不同pH和氮素形態(tài)處理下的植株生物量進(jìn)行方差分析，各個(gè)處理間差異顯著（表1）。pH為7時(shí)，紫花苜蓿地上和地下生物量均為最高。pH小于7時(shí)，生物量隨pH的增加而增加，pH大于7時(shí)，生物量隨pH的增加而減少。pH大于7時(shí)的地上和地下生物量均高于pH值小于7時(shí)，這可能是由于在根瘤菌與植株的共生過(guò)程中，分離了其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生酸，降低了根際周圍的pH值，從而減弱了pH對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用。同時(shí)，銨態(tài)氮處理下的植株地上和地下生物量都高于硝態(tài)氮處理，表明銨態(tài)氮更有利于紫花苜蓿植株生物量的積累。司江英等［8］的研究也表明，以NH4＋－N為氮源的白羽扇豆生物量積累和根冠比也高于NO3－－N。

圖4 pH值和氮素形態(tài)下的紫花苜蓿根系全氮含量Fig.4 Effect of pH value and nitrogen forms on root total nitrogen content of alfalfa

表1 pH值和氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿地上、地下生物量的影響Table 1 Effects of pH value and nitrogen forms on aboveground and underground biomass of alfalfa

3 討論

研究結(jié)果表明，紫花苜蓿是對(duì)pH脅迫敏感的植物，過(guò)低或過(guò)高的pH對(duì)苜蓿與根瘤菌的共生固氮效果具有抑制作用。氮素是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素和一些激素等的重要組成部分，是限制植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的重要因素［12，13］。紫花苜蓿與根瘤菌的有效共生作用除了受品種、菌系影響外，往往受到生態(tài)環(huán)境與肥力的影響［14］。總之pH為7或略微偏堿性條件較適宜紫花苜蓿的生長(zhǎng)，苜蓿對(duì)堿性條件的耐受性更強(qiáng)于酸性條件。根瘤菌的生長(zhǎng)有一個(gè)最適的pH范圍，pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)，根瘤菌生長(zhǎng)速率較低，導(dǎo)致總根瘤數(shù)相對(duì)較少。關(guān)于低pH抑制根瘤菌和苜蓿根生長(zhǎng)的機(jī)理，可能是由于低pH導(dǎo)致信號(hào)分子（NF）量減少，降低了信號(hào)分子的活性并使根瘤菌對(duì)植物的信號(hào)分子的修飾、分解作用受到影響，甚至抑制nod基因的表達(dá)，降低了根瘤菌對(duì)苜蓿根毛的侵染能力；在強(qiáng)酸條件下，苜蓿根系質(zhì)膜H＋－ATPase酶的活性會(huì)發(fā)生變化，以減輕苜蓿根系受到傷害［15］。同時(shí)，低pH脅迫下，苜蓿對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力下降，致使苜蓿的光合作用降低，影響結(jié)瘤過(guò)程中根瘤菌糖類和ATP的供應(yīng)，從而導(dǎo)致苜蓿根系結(jié)瘤減少和生長(zhǎng)受阻。而在高pH下紫花苜蓿的結(jié)瘤固氮強(qiáng)于低pH下，可能與苜蓿根瘤菌產(chǎn)酸的生理特性有關(guān)，降低了根際周圍的pH，使紫花苜蓿的生長(zhǎng)狀況比實(shí)際pH梯度時(shí)生長(zhǎng)的好，相關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)在本研究中，銨態(tài)氮下培養(yǎng)的紫花苜蓿根瘤數(shù)、根瘤重、固氮酶活性、根系全氮含量和生物量均高于硝態(tài)氮下培養(yǎng)。分析原因，一方面是硝態(tài)氮使宿主根毛形成受阻遏或彎曲，硝態(tài)氮在呼吸消耗過(guò)程中減少了光合產(chǎn)物向根瘤的運(yùn)輸，延遲了根瘤的形成和增大，從而進(jìn)一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮［16－19］，另一方面由于同化硝態(tài)氮的關(guān)鍵酶－NR與固氮酶對(duì)鉬具有競(jìng)爭(zhēng)性，減少了鉬鐵蛋白的形成，從而降低了共生固氮的固氮酶活性［17］。同時(shí)嚴(yán)君［12］，宋海星［17］研究也表明，NO3－－N與NH4＋－N均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，但NH4＋－N對(duì)根瘤固氮的抑制作用明顯低于NO3－－N。而具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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