冷強，張竹

（1.海林市園林管理站，黑龍江 海林 157100；2.大慶醫(yī)學高等?？茖W校）

丁香常用的繁殖方法有播種、嫁接和扦插等，但由于播種繁殖發(fā)芽率低，嫁接繁殖成活率較低，扦插繁殖的繁殖系數(shù)小、周期長，均難以滿足市場對種苗的需求。本文旨在探討通過植物組織培養(yǎng)方法獲得小葉丁香的種苗以供園林綠化使用，也為同種植物的組織培養(yǎng)提供一定的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取小葉丁香的莖段、葉片為外植體進行組織培養(yǎng)，小葉丁香母株取于牡丹江師范學院植物園。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌

取小葉丁香的莖和葉片流水沖洗1h，在0.1%升汞中滅菌30s、1min、2min，或在65%次氯酸鈉中滅菌1min、2min、3min，滅菌后將小葉丁香的莖（帶腋芽部分）剪成1～2cm的段狀插入不同的培養(yǎng)基中，將葉片剪成（1×1）cm2大小，平放于不同的脫分化 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 外植體的脫分化培養(yǎng)

小葉丁香的葉片消毒后，用無菌水沖洗5～6次，無菌吸水紙吸干表面水分，切成（1×1）cm2，分別接入以下培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接外植體50個。

A：MS＋6－BA4mg／L＋NAA2mg／L

B：MS＋6－BA3mg／L＋NAA2mg／L

C：MS＋6－BA2.5mg／L＋NAA2mg／L

D：MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L

E：MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA2mg／L

F：MS＋6－BA1mg／L＋NAA2mg／L

G：MS＋6－BA0.5mg／L＋NAA2mg／L

1.2.3 小葉丁香腋芽的促生

取小葉丁香的莖段在65%的次氯酸鈉中浸泡2min滅菌之后，用無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成1～2cm的莖段然后分別接入含有不同濃度6－BA的 MS培養(yǎng)基中（具體濃度見表4），并定時觀察。

1.2.4 生根培養(yǎng)

在無菌實驗臺上將上一步小葉丁香莖段所促生出的腋芽切下，分別接入含有不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)（具體濃度見表5），并定時觀察。

1.2.5 培養(yǎng)條件

光培養(yǎng)25℃﹑6000 lx、14h光照／10h黑暗。

2 結果與分析

2.1 不同消毒液及不同消毒時間對小葉丁香外植體的影響

為篩選出最佳的滅菌方法，我們采用不同滅菌劑及不同滅菌時間對小葉丁香外植體進行滅菌。試驗結果表明：莖和葉片在0.1%的升汞中滅菌30s時其生長情況最佳，長菌率為0，滅菌1min和2min時，雖然長菌率也為0，但是會引起外植體的死亡；莖在65%的次氯酸鈉中滅菌2min時，外植體的滅菌效果最好，葉片在次氯酸鈉中的最佳滅菌時間為1min。因為升汞對外植體的毒害情況比次氯酸鈉更嚴重（見表1、表2），因此莖段的最佳滅菌條件為次氯酸鈉滅菌2min，葉片最佳滅菌條件為次氯酸鈉滅菌1min。

表1 以0.1%升汞為消毒液對小葉丁香外植體最佳消毒時間的篩選

表2 以65%的次氯酸鈉為消毒液對小葉丁香外植體最佳消毒時間的篩選

2.2 最佳脫分化培養(yǎng)基的篩選

取小葉丁香的葉片在65%次氯酸鈉中滅菌1min，無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成（1×1）cm2大小，分別接入不同的脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種30片。試驗結果表明：隨著6－BA的濃度遞減，脫分化率有先增加后減少的趨勢，其中A、F、G號培養(yǎng)基中，外植體均沒有脫分化，說明6－BA濃度過高或過低都會影響外植體的脫分化；在D號培養(yǎng)基中 （MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L）外植體的脫分化率最高為13.3%?？傮w來看外植體的脫分化率較低，而且出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象。褐化現(xiàn)象受很多因素的影響，例如：外植體的基因型、生理狀態(tài)、大小、種類，光照等等［1－2］。由表3可見，不同的激素濃度對外植體褐化的影響程度不同，其中A、F、G號培養(yǎng)基上外植體褐化最嚴重，全部外植體均發(fā)生褐化。

表3 培養(yǎng)基對小葉丁香葉片脫分化的影響

2.3 小葉丁香莖段最佳腋芽促生培養(yǎng)基的篩選

取小葉丁香的莖在65%的次氯酸鈉中浸泡2min滅菌后，用無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成帶腋芽的約1～2cm長的莖段，分別接入以下培養(yǎng)基中培養(yǎng)，試驗結果表明：隨著6－BA濃度的增加，不僅促生的腋芽數(shù)有所增加而且促生腋芽的時間有所縮短，說明6－BA有誘導促生腋芽的良好作用，但這一濃度高于2mg／L時出現(xiàn)下降趨勢，確定以莖段促生腋芽的最適培養(yǎng)基為MS＋6－BA2mg／L。

表4 不同培養(yǎng)基對莖段生腋芽的影響

2.4 最適生根培養(yǎng)基的篩選

在超凈工作臺上將由小葉丁香莖段促生得到腋芽切下，接入含有不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，并定時觀察。試驗結果如下：隨著NAA濃度的增加，腋芽生根率增加而且發(fā)根時間縮短，說明NAA的確有誘導生根的良好作用，當NAA濃度高于0.5mg／L時，生根率呈現(xiàn)下降趨勢。試驗確定腋芽生根最適培養(yǎng)基為 MS＋NAA0.5mg／L。

表5 不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基對腋芽生根的影響

3 結論

3.1 試驗結果表明：莖段在0.1%的升汞中浸泡30s后生長情況最佳，長菌率為0%如果時間太長會發(fā)生組織的損傷從而引起褐化，而在65%的次氯酸鈉中浸泡2min其滅菌最徹底；葉片在0.1%的升汞中浸泡30s后生長情況最佳，在65%的次氯酸鈉中浸泡1min生長情況最佳；由于升汞對外植體的毒害比次氯酸鈉更嚴重，所以我們在對外植體滅菌時一般使用次氯酸鈉；

3.2 小葉丁香葉片脫分化最佳培養(yǎng)基為 MS＋NAA2mg／L＋6－BA2mg／L；

3.3 小葉丁香莖段生腋芽最佳培養(yǎng)基為 MS＋6－BA2mg／L；

3.4 小葉丁香腋芽生根最佳培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.5 mg／L。

圖1 小葉丁香葉片愈傷組織的發(fā)生情況圖

圖2 小葉丁香腋芽的生根情況

［1］曾鐳，劉燕.植物組織培養(yǎng)中褐化問題的研究進展［J］.安徽農(nóng)學通報，2007，13（14）：49－50.

［2］王棟，買合木提·克衣木，玉永雄，等.植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2008（1）：7－10.