侯進(jìn)慧，劉全德，高兆建，孔文剛，蔡 侃

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

牛蒡根際耐Cd2+菌株的分析

侯進(jìn)慧，劉全德，高兆建，孔文剛，蔡 侃

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

采用純培養(yǎng)法，從牛蒡根際土壤中分離耐Cd2+菌株，對耐Cd2+菌株的耐性和種群多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：分離到10株耐Cd2+菌株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定，耐Cd2+菌株分別屬于Bacillus subtilis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、Pseudomonas sp.。其中，Pectobacterium carotovorum NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39等3株菌株的對Cd2+耐性最高，在Cd2+質(zhì)量濃度為400mg/L固體LB培養(yǎng)基中可正常生長。

牛蒡；根際；耐Cd2+細(xì)菌

有東洋參之稱的草本植物牛蒡(Arctium lappa L.)，肉質(zhì)根肥大，具有抗菌、抑制腫瘤的功效，是一種可食用且營養(yǎng)價(jià)值較高的農(nóng)產(chǎn)品。江蘇徐州的豐縣是我國牛蒡的主產(chǎn)區(qū)，其牛蒡種植面積占到全國的40%以上，多出口到日本、韓國等地區(qū)，經(jīng)濟(jì)效益較高[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對于食品原料的質(zhì)量日益重視。其中，消除重金屬對食品的污染是當(dāng)前需要關(guān)注的一個(gè)問題。重金屬污染是指重金屬及其化合物對大氣、土壤和水質(zhì)等環(huán)境的污染。常見的重金屬元素有鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)等，它們可能通過食物鏈系統(tǒng)進(jìn)入人體，危害人類的健康。在元素周期表中，鎘屬于第二副族，其單質(zhì)是銀白色有光澤的金屬，因其具有致突變、致畸及致癌“三致”作用，必須從環(huán)境中富集去除，才能達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的，因此該元素一直是環(huán)境修復(fù)研究的重點(diǎn)[2]。通過微生物進(jìn)行重金屬富集研究顯示，很多種類的微生物都有較好的富集作用。在對植物的研究中，根際作為植物與土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的活躍界面，是相關(guān)研究的熱點(diǎn)。根際微環(huán)境聯(lián)系著植物與土壤，控制著重金屬等污染物從土壤向植物的遷移。根際微生物通過多種方式影響土壤重金屬的毒性和生物可利用性。篩選耐受重金屬的微生物是開發(fā)微生物富集和修復(fù)的基礎(chǔ)。對于微生物耐Cd2+的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都需要不斷深入。

本實(shí)驗(yàn)從牛蒡根際土壤中分離篩選耐Cd2+細(xì)菌，分析不同菌株對Cd2+的耐受特征，并利用16S rDNA序列分析牛蒡根際耐Cd2+菌株的種群特征，為進(jìn)一步探索根際微生物控制重金屬污染物從土壤向植物的遷移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

從牛蒡產(chǎn)地多個(gè)不同生長點(diǎn)隨機(jī)取樣，采集多株牛蒡，并與根際土壤一同帶到實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天完成菌株分離工作。采樣工作在兩年里進(jìn)行了12次。

1.1.2 試劑

PCR反應(yīng)試劑、DNA marker 天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(luria-bertani)液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上每升還需加瓊脂粉12g。高壓滅菌。在配制不同質(zhì)量濃度含Cd2+培養(yǎng)基時(shí)，加入滅菌后的CdSO4溶液, 使Cd2+質(zhì)量濃度分別為50、100 、200、400mg/L。

1.2 菌株分離

從牛蒡根際土壤中分離菌株，在培養(yǎng)基中逐漸改變Cd2+的質(zhì)量濃度(50、100、200、400mg/L)，篩選耐Cd2+菌株，進(jìn)一步分離純化獲得相應(yīng)抗性的菌落。

1.3 菌株基因組DNA提取

（2）若有空，則提示用戶輸入完整；若均已輸入，則系統(tǒng)檢驗(yàn)該用戶名、郵箱和手機(jī)號是否已被注冊，即遍歷用戶表查詢是否有相同信息，若有相同記錄則提示用戶該用戶名/郵箱/手機(jī)號已被注冊，否則用戶注冊成功，跳轉(zhuǎn)至登錄界面。

采用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀的方法提取菌株基因組DNA，瓊脂糖凝膠檢測DNA，選擇質(zhì)量較好的菌株基因組DNA作為 PCR反應(yīng)模板[3]。

1.4 菌株分子鑒定

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 序列保守性設(shè)計(jì)合成引物[4]：F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

1.4.2 PCR擴(kuò)增16S rDNA序列

PCR反應(yīng)體系是50μL，其中有10 × PCR反應(yīng)緩沖液5μL、dNTP 4μL、上下游引物各1μL、基因組DNA模板1μL、Long Taq DNA 聚合酶0.5μL，加無菌超純水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件是95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min[4-6]。

1.4.316 S rDNA序列分析

菌株16S rDNA序列送上海生工生物工程技術(shù)公司測序。用Blast程序在GenBank基因庫中將獲得的16S rDNA序列進(jìn)行序列比對，分析各菌株的分類地位。使用Dnaman程序構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡根際耐Cd2+菌株的分離

圖1 不同質(zhì)量濃度Cd2+培養(yǎng)基上菌落生長情況Fig.1 Colony growth on culture media with various Cd2+concentrations

首先篩選出耐50mg/L Cd2+的菌株，再提高培養(yǎng)基中Cd2+質(zhì)量濃度，依次獲得耐受質(zhì)量濃度為100、200、400mg/L Cd2+的菌株。由圖1可知，在低質(zhì)量濃度時(shí)菌落較大，隨著質(zhì)量濃度升高，菌落生長明顯變緩慢，菌落直徑也變小。

2.2 菌株分類和最小抑菌質(zhì)量濃度

提取菌株基因組DNA，使用細(xì)菌16S rDNA 序列保守性引物擴(kuò)增各菌株的16S rDNA。將16S rDNA 的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1g/100mL瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得特異條帶(圖2)。將序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，獲得相關(guān)序列。分析各菌株的序列特征，確定分類地位。這些物種屬于2個(gè)門，即厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，分屬于5個(gè)屬的菌種，分別是腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)和厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌屬(Bacillus)。篩選出的10株耐Cd2+菌株分類和最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)見表1。

表1 牛蒡根際耐Cd2+菌株類群和最小抑菌Cd2+質(zhì)量濃度Table 1 Cd2+-resistant strains from Arctium lappa rhizosphere and their MICs

圖2 16S rDNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of 16S rDNA

2.3 菌株系統(tǒng)演化關(guān)系分析

將篩選出的抗性菌株16S rDNA序列進(jìn)行分析，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中找尋相關(guān)的序列，進(jìn)行相似性比對。本實(shí)驗(yàn)選取親緣關(guān)系較近的菌株，使用MEGA4.0軟件對16S rDNA序列進(jìn)行Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。分離獲得的牛蒡根際耐Cd2+菌株分別屬于Bacillus subtilis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、 Pseudomonas sp.。其中，Pectobacterium carotovorum NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39菌株的耐Cd2+性最高，在Cd2+質(zhì)量濃度為400mg/L固體LB培養(yǎng)基中可生長。分析牛蒡根際耐Cd2+菌株的類群可見，克雷伯菌屬(Klebsiella)菌株較多，假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)次之。而芽胞桿菌屬(Bacillus)僅分離到一株，且MIC只有50mg/L。

圖3 牛蒡根際耐Cd2+菌株及其在GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬細(xì)菌的16S rDNA為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on partial and aligned 16S rDNA sequences of Cd2+-resistant strains isolated from Arctium lappa rhizosphere and their nearest strains

3 討 論

在德國學(xué)者Lorenz Hiltner提出根際概念的一百多年中，根際研究不斷發(fā)展，而分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用又極大地推動了根際微生物的研究。植物根際分泌物和根的脫落物都位于根際，其中富含有機(jī)物質(zhì)，這就導(dǎo)致植物根際微生物的種類和數(shù)量與非根際土壤都有所不同。微生物重金屬污染生物修復(fù)技術(shù)日益受到研究者的重視，這一研究的前提是從環(huán)境中分離高耐受和富集能力的微生物菌株。國外有研究者從廢棄礦山中篩選獲得對Cd2+有很強(qiáng)的抗性和富集能力的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)[7]。國內(nèi)有學(xué)者分離到一株在Cd2+200mg/L的培養(yǎng)基上正常生長的菌株[2]。文獻(xiàn)資料顯示[7-12]，Cd2+耐性菌株主要是陰溝腸桿菌、克雷伯氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌等類群。本研究獲得的Cd2+耐性菌株分別是腸桿菌、假單胞菌、克雷伯氏菌、果膠桿菌和芽孢桿菌，與國外研究基本吻合。但牛蒡根際僅分離到一株耐Cd2+芽孢桿菌，且對Cd2+耐性僅是50mg/L，同時(shí)新發(fā)現(xiàn)一株耐Cd2+400mg/L的果膠桿菌NP22，具有深入研究價(jià)值。對于不同類群Cd2+耐性菌株的分析，有利于分析微生物對重金屬的耐性機(jī)理。目前研究認(rèn)為，導(dǎo)致微生物重金屬耐性的原因主要有胞外沉淀、細(xì)胞表面吸附、主動運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)隔離、酶解毒等[13-15]。課題組將會對分離到的耐性菌株的耐受機(jī)理和應(yīng)用研究做進(jìn)一步的分析。

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Preliminary Analysis of Cd2+-Resistant Bacteria from Arctium lappa Rhizosphere

HOU Jin-hui，LIU Quan-de，GAO Zhao-jian，KONG Wen-gang，CAI Kan
(College of Food Engineering (Bioengineering), Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Cultivable Cd2+-resistant bacterial strains were isolated from burdock rhizosphere by pure culture, and Cd2+-resistant MIC and bacterial strain diversity were analyzed. The results showed that 10 Cd2+-resistant strains were isolated and identified as Bacillus subtilis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter ludwigi, Klebsiella sp., Pectobacterium carotovorum and Pseudomonas sp. by 16S rDNA sequence. Among these strains, Pectobacterium carotovorum NP22, Enterobacter ludwigii NP23 and Pseudomonas sp. NP39 had the highest MIC, which was up to 400 mg/L Cd2+on solid LB plate.

Arctium lappa；rhizosphere；Cd2+-resistant bacteria

TS201.21

A

1002-6630(2012)11-0177-04

2011-06-09

江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(XZZD0924)；徐州工程學(xué)院?？蒲许?xiàng)目(XKY2011110)；徐州工程學(xué)院2011年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目

侯進(jìn)慧(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：houjinhui0@126.com