韓 櫻，何 慧*，趙寧寧，李江濤，王真真，聶志奎

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

蛋清肽-鈣配合物體內(nèi)促鈣吸收作用研究

韓 櫻，何 慧*，趙寧寧，李江濤，王真真，聶志奎

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

目的：為了考察蛋清肽-鈣配合物(EWP-Ca)在動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)鈣效果。方法：將60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為6組：普通組、缺鈣模型組、CaCO3組以及低、中、高劑量EWP-Ca組，通過構(gòu)造缺鈣大鼠模型，進(jìn)行了為期30d的補(bǔ)鈣實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各種與補(bǔ)鈣相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：與缺鈣模型組相比，高劑量EWP-Ca組(Ca劑量為106.4mg/(kg·d))能極顯著增加大鼠股骨直徑、干質(zhì)量、骨鈣含量及股骨密度(P＜0.01)，極顯著降低血清堿性磷酸酶(AKP)活力(P＜0.01)；與鈣含量相同的CaCO3組相比，EWP-Ca高劑量組股骨直徑、骨鈣含量極顯著和顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)論：EWP-Ca具有體內(nèi)促進(jìn)鈣吸收作用，且效果優(yōu)于鈣含量相同的CaCO3。

蛋清肽；蛋清肽-鈣配合物；促鈣吸收；補(bǔ)鈣制劑

我國是世界上最大的蛋品生產(chǎn)國，但目前蛋品加工水平卻較低、技術(shù)陳舊，同時(shí)由于某些飲食習(xí)慣和行業(yè)的特殊需求，對(duì)蛋黃的需求量較大，比如做月餅、蛋黃派等，其副產(chǎn)物——蛋清常被低值利用甚至被當(dāng)成廢棄物丟棄，也污染了環(huán)境[1]。蛋清蛋白是食物中最理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其氨基酸組成非常適合人體需要，利用率高達(dá)99.6%，但由于其受熱易凝固等性質(zhì)也使其應(yīng)用受到了一定程度的限制[2]。而將其酶法改性后卻能得到具有多種生理活性的蛋清肽(egg white peptides，EWP)，使其附加值大大提高。

鈣是人體必需的常量元素，參與機(jī)體多種生理活動(dòng)。人類缺鈣是全球性的營養(yǎng)問題，可導(dǎo)致人體產(chǎn)生骨質(zhì)疏松、佝僂癥等多種疾病，甚至對(duì)心血管也會(huì)產(chǎn)生極大的負(fù)作用，然而人們卻一直找不到有效、經(jīng)濟(jì)的鈣源補(bǔ)充[3]。小肽能與鈣離子形成可溶性螯合物，完整地被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，需要時(shí)又能有效地將鈣離子釋放出來，同時(shí)還能補(bǔ)充一定的氨基酸[4]。與其他補(bǔ)鈣劑相比，它更易被快速吸收，穩(wěn)定性更好。

國內(nèi)外已有不少學(xué)者研究了肽-鈣配合物、氨基酸-鈣螯合物的補(bǔ)鈣作用。Choi等[5]研究了卵黃高磷蛋白磷酸肽的鈣結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)組的飼料中加入0.125%～0.5%卵黃高磷蛋白磷酸肽-鈣配合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的SD大鼠的骨密度和骨礦物質(zhì)含量較空白組顯著提高，表明卵黃高磷蛋白磷酸肽-鈣配合物能夠有效提高鈣的生物利用率，促進(jìn)鈣質(zhì)沉積于骨骼。菅景穎[6]對(duì)膠原多肽-鈣配合物的研究表明，其無論是在對(duì)骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防，還是在促進(jìn)骨骼生長和壯骨方面，效果均十分理想，效果優(yōu)于葡萄糖酸鈣和CaCO3。但目前尚未見有研究蛋清肽-鈣配合物(EWP-Ca)補(bǔ)鈣功能的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)EWP-Ca促鈣吸收功能進(jìn)行研究，通過在最優(yōu)條件下制得的EWP-Ca，飼喂缺鈣大鼠一個(gè)月，研究該配合物對(duì)處于生長期的大鼠的骨骼發(fā)育的影響，為該產(chǎn)品在今后進(jìn)一步用于人體補(bǔ)鈣提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量(80±5)g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心, 許可證號(hào)：SCXK(鄂) 2008-0005。

按照文獻(xiàn)[7]的方法制備EWP-Ca，再經(jīng)截留分子質(zhì)量為5kD的超濾膜處理，收集膜透過級(jí)分，凍干，其鈣結(jié)合率為16.45%。

CaCO3(優(yōu)級(jí)純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清鈣試劑盒、血清磷試劑盒、血清堿性磷酸酶試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AA-6300C原子吸收分光光度儀 日本島津公司；XR-36雙能X線骨密度儀 美國Norland公司；5810/R低溫高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Ⅰ型游標(biāo)卡尺 南京三豐機(jī)電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 自制缺鈣飼料和普通飼料

實(shí)驗(yàn)為建立缺鈣模型，自制缺鈣飼料，配方見表1。經(jīng)原子吸收法測(cè)定，其中鈣含量為0.01%。為了保證基礎(chǔ)營養(yǎng)成分的一致，同時(shí)自制了鈣含量0.35%的普通飼料，其中鈣來源于添加的CaCO3。

表1 飼料成分表Table 1 Feed composition %

1.3.2 EWP-Ca的制備

雙酶法制備蛋清肽參照文獻(xiàn)[7]方法，將上清液過截留分子質(zhì)量為5kD的超濾膜，濾液冷凍干燥得蛋清肽粉，配制成4g/100mL的初始肽液，在55℃、pH9.5、肽粉與CaCl2質(zhì)量比2.5:1的條件下，與0.5g/mL CaCl2溶液混合攪拌20min，經(jīng)過乙醇沉淀、離心分離及冷凍干燥后，制得EWP-Ca。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

鈣含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]所述方法進(jìn)行；粗蛋白含量測(cè)定：采用微量凱式定氮法[9]；多糖含量測(cè)定：參照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》方法。

1.3.4 分組與給藥方式

大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為普通組、缺鈣模型組、CaCO3組和EWP-Ca低、中、高劑量組。各組動(dòng)物喂以對(duì)應(yīng)的飼料，普通組和缺鈣模型組灌胃去離子水。EWP-Ca低、中、高劑量組，分別為每天灌胃不同劑量的EWP-Ca；CaCO3組每天灌胃CaCO3，折算鈣元素含量與EWP-Ca高劑量組相同。灌胃量為0.3mL。每兩天稱量一次動(dòng)物體質(zhì)量。具體方法見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)分組列表Table 2 Rat grouping

實(shí)驗(yàn)至30d后，將動(dòng)物摘眼球處死，收集血液，4℃、104r/min離心15min，取出血清。同時(shí)取出兩側(cè)股骨，分別放入烘箱中60℃條件下烘干至恒質(zhì)量。

1.3.5 血清鈣、磷及堿性磷酸酶測(cè)定

參照南京建成生物工程研究所試劑盒方法測(cè)定。

1.3.6 股骨干質(zhì)量、長度、直徑、骨密度及骨鈣含量的測(cè)定

取出大鼠左側(cè)股骨，用游標(biāo)卡尺精確測(cè)定長度、股骨中心直徑。采用Norland XR-36雙能X線骨密度儀測(cè)定左股骨骨密度。取右側(cè)烘干后的股骨稱量股骨干質(zhì)量，再經(jīng)混和酸(硝酸、高氯酸體積比4:1) 濕法消化后，以0.5%的氯化鍶溶液定容，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定骨鈣含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠飼料組分分析

表3 飼料組分分析Table 3 Analysis of feed ingredients

大鼠對(duì)各種營養(yǎng)物含量的需求為蛋白質(zhì)＞20%，碳水化合物＞60%，鈣元素約0.5%。由表3可知，普通飼料組分測(cè)定結(jié)果基本可滿足大鼠正常生長的需要，不會(huì)產(chǎn)生營養(yǎng)缺乏病；缺鈣飼料則要求鈣含量＜0.1%，故也符合要求。

2.2 蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響

表4 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響()Table 4 Effect of EWP-Ca on serum indices of rats ()

表4 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響()Table 4 Effect of EWP-Ca on serum indices of rats ()

注：*.與缺鈣模型對(duì)照組比較，差異顯著(P＜0.05)；**.與缺鈣模型對(duì)照組比較，差異極顯著(P＜0.01)；Δ.與CaCO3組比較，差異顯著(P＜0.05)；Δ Δ.與CaCO3組比較，差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別血清鈣含量/血清磷含量/血清堿性磷酸酶活力/ (mmol/L)(mmol/L)(金氏單位/100mL)普通組1.892±0.108**2.181±0.18059.50±9.13**缺鈣模型組1.430±0.1422.178±0.26983.59±10.96 CaCO3組2.098±0.143**2.191±0.48862.59±6.72**低劑量1.928±0.151**2.010±0.37779.70±6.81 EWP-Ca組 中劑量1.948±0.114**2.040±0.16959.36±13.71**高劑量2.131±0.149**2.201±0.27549.26±9.41**ΔΔ

由表4可知，缺鈣模型組大鼠血清鈣含量極顯著低于其余5組 (P＜0.01)，說明通過飼喂自制的缺鈣飼料來構(gòu)造缺鈣模型是成功的；各組之間血清磷含量差異均不顯著(P＞0.05)；除低劑量EWP-Ca外，其余4組的血清堿性磷酸酶(AKP)的活力均極顯著低于缺鈣模型組(P＜0.01)，且高劑量EWP-Ca組明顯低于相同鈣劑量的CaCO3組，兩者之間差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。血清AKP是由成骨細(xì)胞釋放，在肝臟功能正常的情況下，血清AKP水平能較好地反映成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀況，是骨形成的特異性指標(biāo)。血清中的AKP主要來自肝臟與骨胳，當(dāng)處于一些疾病狀態(tài)下AKP會(huì)釋放進(jìn)入血清。缺鈣模型組的血清AKP最高，說明該組動(dòng)物由于缺鈣嚴(yán)重，出現(xiàn)了高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，因此AKP值不斷上升，這與劉忠厚[10]研究骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的高骨轉(zhuǎn)換率時(shí)，AKP明顯升高的結(jié)論相一致。

2.3 蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨指標(biāo)的影響

2.3.1 蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨長度、直徑的影響

表5 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨長度、股骨直徑的影響()Table 5 Effect of EWP-Ca on femur length and femur diameter of rats ()mm

表5 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨長度、股骨直徑的影響()Table 5 Effect of EWP-Ca on femur length and femur diameter of rats ()mm

組別股骨長度股骨直徑普通組30.34±0.703.42±0.25缺鈣模型組30.86±1.333.56±0.21 CaCO3組31.10±1.313.54±0.22低劑量31.02±1.433.59±0.26 EWP-Ca組 中劑量31.46±0.963.58±0.23高劑量31.06±0.973.90±0.19**ΔΔ

由表5可知，各組間大鼠股骨長度均無顯著差異。高劑量EWP-Ca組股骨直徑明顯高于其他任何一組，與缺鈣模型組和CaCO3組相比較，差異均達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，EWP-Ca可以增加大鼠股骨直徑即股骨中心寬度，并且效果優(yōu)于鈣含量相同的CaCO3組。

2.3.2 蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨干質(zhì)量、骨鈣含量的影響

表6 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨干質(zhì)量、骨鈣含量的影響Table 6 Effect of EWP-Ca on femoral weight and calcium content of rats

表6 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨干質(zhì)量、骨鈣含量的影響Table 6 Effect of EWP-Ca on femoral weight and calcium content of rats

組別股骨干質(zhì)量/g骨鈣含量/(mg/g)普通組0.28±0.05163.58±12.93*缺鈣模型組0.26±0.05148.93±15.49 CaCO3組0.31±0.03**153.11±7.43低劑量0.27±0.05156.43±12.62 EWP-Ca組 中劑量0.28±0.03153.73±9.45高劑量0.31±0.03**167.95±12.09**Δ

由表6可知，缺鈣模型組大鼠股骨干質(zhì)量明顯低于其他任何一組；與缺鈣模型組相比，高劑量EWP-Ca組和CaCO3組的股骨干質(zhì)量均極顯著提高(P＜0.01)；普通組股骨鈣含量顯著高于缺鈣模型組(P＜0.05)，而高劑量EWP-Ca組股骨鈣含量極顯著高于缺鈣模型組(P＜0.01)，并且顯著高于鈣含量相同的CaCO3組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，高劑量的EWP-Ca的補(bǔ)鈣效果優(yōu)于鈣含量相同的CaCO3。

2.3.3 蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨密度的影響

表7 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨密度的影響(Table 7 Effect of EWP-Ca on bone mineral density of rats

表7 飼喂蛋清肽-鈣配合物對(duì)大鼠股骨密度的影響(Table 7 Effect of EWP-Ca on bone mineral density of rats

組別股骨近心端密度股骨中心端密度股骨遠(yuǎn)心端密度普通組0.220±0.026**0.185±0.017**0.262±0.032**缺鈣模型組0.169±0.0280.138±0.0200.193±0.030 CaCO3組0.210±0.014**0.158±0.056**0.250±0.025**低劑量0.195±0.020*0.167±0.012**0.217±0.022*EWP-Ca組 中劑量0.207±0.015**0.173±0.015**0.227±0.019**高劑量0.231±0.032**0.186±0.013**0.264±0.020**

由表7可知，與缺鈣模型組比較，其余5組股骨近心端密度均顯著提高，5組中低劑量EWP-Ca組的差異顯著(P＜0.05)，其他4組均有極顯著差異(P＜0.01)，EWP-Ca低、中、高劑量組呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。股骨遠(yuǎn)心端骨密度值變化趨勢(shì)與近心端相似。比較股骨中心端骨密度值，普通組、CaCO3組、EWP-Ca中劑量和高劑量組均極顯著高于缺鈣模型組(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，中劑量及以上的EWP-Ca配合物具有極顯著增加大鼠股骨密度的作用。

3 討 論

已有研究[11]表明：大部分骨量(即骨礦含量)的累積發(fā)生在兒童和青少年期，兒童期充足的鈣攝入不但可促進(jìn)兒童的生長發(fā)育，而且對(duì)骨的完整性和健康生長非常重要，可使在青年期達(dá)到較高的峰值骨量[12]，而且對(duì)于降低老年期因骨質(zhì)疏松引起的骨折危險(xiǎn)性有著重要作用。因此，兒童期補(bǔ)鈣尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用4周齡的Wistar大鼠作為受試動(dòng)物，此時(shí)的大鼠正處于青少年增長期，對(duì)鈣需要量較大，也是骨骼成長發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)刻。采用此階段的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行補(bǔ)鈣研究，能夠模擬對(duì)兒童補(bǔ)鈣及達(dá)到成年后對(duì)骨骼發(fā)育的影響。人在20歲以前主要為骨的生長階段，其后的10余年骨質(zhì)仍繼續(xù)增加，故在35～40歲左右，單位體積內(nèi)骨質(zhì)達(dá)到頂峰，此后，骨質(zhì)逐漸丟失，骨的密度降低到一定程度時(shí)，就不能保持骨骼結(jié)構(gòu)的完整，甚至壓縮變形，以后在很小外力作用下極可能發(fā)生骨折。所以補(bǔ)鈣是人類一生中的大問題，從孕婦到兒童、中年、老年均需不斷補(bǔ)充鈣質(zhì)。

目前市場(chǎng)上口服補(bǔ)鈣制劑品種繁多，使廣大消費(fèi)者應(yīng)接不暇，不知道何種補(bǔ)鈣制劑效果好。我國的膳食組成以植物性食物為主，含鈣量少，導(dǎo)致鈣磷比值嚴(yán)重倒置，不利于鈣的吸收利用，同時(shí)膳食中含有的植酸或草酸易與鈣鹽結(jié)合為不溶性化合物而影響鈣的吸收。為此，實(shí)驗(yàn)初步探討了不同補(bǔ)鈣制劑在促進(jìn)鈣吸收作用的效果，在本實(shí)驗(yàn)中，雖然高劑量EWP-Ca組與CaCO3組的鈣含量相同，但由于鈣源的吸收度不同，所以最終表現(xiàn)的鈣生物利用率的差別是很大的。結(jié)果表明： EWP-Ca在促進(jìn)骨骼生長、壯骨作用的效果優(yōu)于最常用的補(bǔ)鈣劑——CaCO3，是一種優(yōu)良的補(bǔ)鈣制劑。究其原因，主要是由于骨骼的發(fā)育取決于機(jī)體對(duì)鈣的吸收利用以及與其他有機(jī)物(如蛋白質(zhì))的共同攝入的影響，而鈣的吸收利用受其存在化學(xué)形式的影響。機(jī)體對(duì)鈣的吸收主要發(fā)生在小腸上部，通過下列3種方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[13]：離子鈣、非離子擴(kuò)散鈣(分子鈣)、鈣結(jié)合蛋白。在正常人中，鈣結(jié)合蛋白對(duì)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)能力是一個(gè)常量。而單純依靠鈣結(jié)合蛋白為細(xì)胞內(nèi)提供鈣并不能滿足機(jī)體需要，必須設(shè)法提高離子鈣和分子鈣的補(bǔ)鈣能力。而離子鈣的不足在于在小腸的酸度條件下，Ca2+易生成不溶物，導(dǎo)致其吸收率下降。肽-鈣配合物(又稱螯合鈣)屬于分子型鈣源，進(jìn)入體內(nèi)后，除少數(shù)分解成Ca2+外，其余大部分仍以分子態(tài)存在，并以這種整體的形式被小腸黏膜細(xì)胞直接吸收進(jìn)入血液[14]，因而受其他物質(zhì)干擾減少，金屬元素之間的拮抗作用也降低，故吸收利用率很高。Ashmead 等[15]認(rèn)為氨基酸和小肽螯合金屬鹽可能利用氨基酸和小肽的吸收機(jī)制。Du等[16]的研究也表明，小肽螯合銅是利用了肽的吸收機(jī)制，與鐵、鋅、錳的普通吸收機(jī)制不形成競(jìng)爭(zhēng)。這些研究都證明了這一觀點(diǎn)：氨基酸和肽具有促進(jìn)金屬元素吸收的作用；氨基酸螯合鈣、肽螯合鈣的生物利用率很高。

本實(shí)驗(yàn)表明了EWP-Ca在青少年時(shí)期的持續(xù)添加，能夠明顯提高骨鈣含量，增加股骨密度，可以作為青少年的良好的鈣補(bǔ)充劑。

4 結(jié) 論

與缺鈣模型鼠相比，高劑量的EWP-Ca (其中Ca劑量為106.4mg/(kg·d))能極顯著增加大鼠股骨干質(zhì)量、股骨直徑、骨鈣含量和骨密度(P＜0.01)，極顯著降低血清AKP活力(P＜0.01)；與鈣含量相同的CaCO3組相比，灌胃高劑量EWP-Ca，能使大鼠股骨直徑、骨鈣含量極顯著和顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)，血清AKP活力極顯著降低(P＜0.01)。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》標(biāo)準(zhǔn)，該產(chǎn)品在促進(jìn)骨骼生長發(fā)育方面具有一定的作用，且效果優(yōu)于鈣含量相同的CaCO3。

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Effect of Egg White Peptide Binding with Calcium on Promotion of Calcium Absorption in vivo

HAN Ying，HE Hui*，ZHAO Ning-ning，LI Jiang-tao，WANG Zhen-zhen，NIE Zhi-kui
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Objective: To explore the promoting effect of egg white peptide binding with calcium (EWP-Ca) on calcium absorption in vivo. Methods: Totally 60 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups: normal group, calcium-deficient model group, CaCO3 group and EWP-Ca groups at low, medium and high doses. Calcium-deficient model rats were fed a low-Ca diet, and calcium absorption-related indices were determined after a feeding period of 30 days. Results: EWP-Ca at high dose (106.4 mg/(kg·d)) could significantly increase femur diameter, dry weight, calcium content and bone mineral density (P＜0.01) and could significantly decrease the activity of serum alkaline phosphatase (AKP) (P＜ 0.01) when compared with calcium-deficient model control group. Moreover, compared with CaCO3 group at the same calcium level, femur diameter (P＜0.01) and bone calcium content (P＜0.05) were significantly increased. Conclusion: EWP-Ca can promote calcium absorption in vivo, which is better than CaCO3at the same calcium level.

egg white peptide；egg white peptide binding with calcium (EWP-Ca)；calcium absorption-promoting effect；calcium supplement

TS253.9

A

1002-6630(2012)11-0262-04

2011-06-18

韓櫻(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：kekebeibeihy@126.com

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn