張建新，劉 娜，何桂梅，郭 倩

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

大麥蟲(chóng)超氧化物歧化酶分離純化及性質(zhì)研究

張建新，劉 娜，何桂梅，郭 倩

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

目的：探討大麥蟲(chóng)超氧化物歧化酶(SOD)分離純化條件及其性質(zhì)，為大麥蟲(chóng)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：以大麥蟲(chóng)為原料，經(jīng)鹽析沉淀、DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析等純化， 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法對(duì)蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離并確定其分子質(zhì)量，原子吸收光譜儀鑒定酶的類(lèi)型。結(jié)果：獲得了一種酶比活力較高的大麥蟲(chóng)SOD，酶的純化倍數(shù)為68.54倍，分子質(zhì)量為37.30kD，屬于含銅鋅超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)，且在278nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰，穩(wěn)定性較好，最適溫度為40℃，最適pH值為6.0，對(duì)H2O2、β-巰基乙醇試劑十分敏感，受氯仿-乙醇混合液(3:5，V/V)的影響較小。結(jié)論：大麥蟲(chóng)SOD具有較高的酶比活力，穩(wěn)定性好，具有較高的利用價(jià)值。

大麥蟲(chóng)；超氧化物歧化酶；分離純化；性質(zhì)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一類(lèi)專(zhuān)一的催化超氧陰離子自由基(O2-·)發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶[1]，按其結(jié)合的金屬離子不同，可分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu,Zn-SOD類(lèi)型，具有抗癌、抗輻射、抗衰老等作用[2]，在農(nóng)業(yè)、食品與化妝品工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。大麥蟲(chóng)(Zophobas morio L.)俗稱(chēng)超級(jí)面包蟲(chóng)，屬于鞘翅目，擬步甲科昆蟲(chóng)[3]，與家蠅、黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)、蟋蟀、蠶蛹、蠟蟲(chóng)幼蟲(chóng)等比較，大麥蟲(chóng)的蛋白質(zhì)、氨基酸的含量均居首位，且大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的SOD比活力可達(dá)116.747U/mg[4]，具有較高的抗氧化、抗衰老價(jià)值，是一種不可多得的優(yōu)質(zhì)蛋白源昆蟲(chóng)[5-7]。目前對(duì)洋蟲(chóng)[8]、黃粉蟲(chóng)[9-11]、家蠶[12]、蜂蛹[13-14]、中華蚱蜢[15]等昆蟲(chóng)SOD的研究較為成熟，國(guó)內(nèi)外還尚未見(jiàn)有關(guān)大麥蟲(chóng)SOD性質(zhì)的研究報(bào)道。因此研究大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)中SOD的性質(zhì)，有助于深入了解大麥蟲(chóng)抗氧化和防衰老等作用，為大麥蟲(chóng)的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)購(gòu)自江蘇省南通市周氏生物科技有限公司；液氮冷凍備用。

SOD檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程技術(shù)研究所；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(D530S) TaKaRa生物工程有限公司。

Sephadex G-75、DEAE-Sepharose FF、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris、甘氨酸 西安沃爾森生物科技公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PKl21R高速冷凍離心機(jī) 意大利ALC公司；UV-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；iCE3000原子吸收光譜儀 美國(guó)熱電公司；760CRT型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；層析柱(50cm×20mm) 上海雅東玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大麥蟲(chóng)SOD的分離純化

稱(chēng)取10g大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)，按固液比1:35(m/V)的比例加入pH7.43、0.26mol/L的磷酸鹽溶液勻漿后，靜置提取4h，然后在65℃條件下加熱處理20min，在8000×g、4℃條件下離心20min后，在上清液中加入固體(NH4)2SO4至40%飽和度后于4℃靜置過(guò)夜，4000×g離心100min，上清液繼續(xù)加入固體(NH4)2SO4至80%飽和度，于4℃靜置4h后4000×g離心10min，沉淀用少量0.05mol/L pH7.5的Tris-HCl緩沖液溶解。然后裝入透析袋中對(duì)雙蒸水透析72h，用聚乙二醇(PEG)濃縮至3mL，得到粗酶液。將粗酶液離心，采用DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱0～1mol/L NaC1濃度梯度洗脫，分段收集并檢測(cè)各蛋白峰的SOD比活力。合并活力峰，透析除鹽，用PEG濃縮后的樣品經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析(平衡體積300mL，上樣量5mL，流速0.5mL/min)，用5mmol/L(pH7.8)的磷酸鈉緩沖液洗脫，每管收集4mL，收集酶比活力峰。

1.3.2 大麥蟲(chóng)SOD比活力的測(cè)定

參照南京建成生物工程技術(shù)研究所SOD試劑盒(A001-1)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 大麥蟲(chóng)SOD的酶學(xué)特性

1.3.3.1 大麥蟲(chóng)SOD的熱穩(wěn)定性

將純化后的大麥蟲(chóng)SOD酶液保持其他條件不變，分別置于10～90℃條件下保溫，測(cè)定SOD比活力，觀(guān)察溫度對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力的影響。之后，將純化后的大麥蟲(chóng)SOD分別置于40、50、60、70℃條件下保溫10～180min，測(cè)定SOD剩余酶活力，觀(guān)察大麥蟲(chóng)SOD的熱穩(wěn)定性。

1.3.3.2 大麥蟲(chóng)SOD的酸堿穩(wěn)定性

將純化后的大麥蟲(chóng)SOD酶液將其pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于室溫條件下10min，測(cè)定SOD比活力，觀(guān)察大麥蟲(chóng)SOD的pH值穩(wěn)定性。

1.3.3.3 化學(xué)試劑對(duì)SOD比活力的影響

在酶液中分別加入終濃度為1mmol/L H2O2、5mmol/L H2O2、5mmol/L KCN、氯仿-乙醇(3:5，V/V)、0.5% SDS、1.0% SDS和0.01%β-巰基乙醇、0.05%β-巰基乙醇、5mol/L尿素以及含0.5%乙二胺四乙酸(EDTA)的5mol/L尿素，混合均勻，于室溫反應(yīng)30min后，測(cè)定溶液的酶比活力，按公式(2)計(jì)算化學(xué)試劑對(duì)SOD比活力的抑制率。

1.3.4 大麥蟲(chóng)SOD分子質(zhì)量測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPA GE)方法對(duì)蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)(D530S)為分子質(zhì)量對(duì)照，計(jì)算大麥蟲(chóng)SOD的分子質(zhì)量。其中4%濃縮膠、電壓60V、時(shí)間30min；15%分離膠、電壓30V、時(shí)間180min。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.5 大麥蟲(chóng)SOD的光譜性質(zhì)

用760CRT型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)純化后SOD酶液進(jìn)行全波長(zhǎng)吸收光譜掃描，測(cè)定其紫外區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.6 大麥蟲(chóng)SOD的金屬原子含量鑒定

采用iCE3000型原子吸收光譜儀，測(cè)定純化后的大麥蟲(chóng)SOD酶液中Cu、Zn、Mn、Fe元素的含量[16]。計(jì)算每個(gè)酶分子中含有的金屬原子的種類(lèi)及數(shù)量，從而確定大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)SOD的類(lèi)型。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford法[17]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥蟲(chóng)SOD的分離純化

從大麥蟲(chóng)中提取SOD，經(jīng)鹽析沉淀、DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析等純化步驟，獲得了比活力及純度都比較高的SOD，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大麥蟲(chóng)SOD的純化結(jié)果Table 1 Purification of SOD from Zophobas morio L. larvae

2.2 溫度對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力的影響

圖1 溫度對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of SOD

圖1 表示將酶液在10～90℃條件下保溫10min時(shí)，溫度對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力的影響。在10～60℃，溫度對(duì)SOD比活力的影響不大，當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，SOD比活力急劇下降，達(dá)到80℃，SOD比活力只有原來(lái)的13%；大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)SOD的最適溫度為40℃，此時(shí)酶比活力為231.2U/mg。

2.3 保溫時(shí)間對(duì)大麥蟲(chóng)SOD剩余酶活力的影響

圖2 保溫時(shí)間對(duì)大麥蟲(chóng)SOD剩余酶活力的影響Fig.2 Effect of time on the residual activity of SOD

圖2 表示40～70℃條件下，不同保溫時(shí)間對(duì)大麥蟲(chóng)SOD剩余酶活力的影響，在40、50、60℃條件下保溫180min，其SOD剩余酶活力變化趨勢(shì)無(wú)差異，且保溫時(shí)間對(duì)SOD剩余酶活力的影響較小，在70℃條件下，SO D剩余酶活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇下降，在保溫60min時(shí)，剩余酶活力僅為原有的5.7%。

2.4 pH值對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力的影響

由圖3可知。大麥蟲(chóng)SOD比活力在pH6～8之間比較穩(wěn)定，pH值小于6.0或大于8.0，其酶比活力會(huì)急劇下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道的其他來(lái)源SOD相似。本實(shí)驗(yàn)提取的SOD最適pH值為6.0。

圖3 pH值對(duì)大麥蟲(chóng)SOD的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of SOD

2.5 化學(xué)抑制劑對(duì)SOD比活力的影響

表 2 化學(xué)抑制劑對(duì)SOD比活力的影響Table 2 Effect of chemical reagents on the activity of SOD

由表2可知，大麥蟲(chóng)SOD對(duì)H2O2試劑十分敏感，1mmol/L H2O2即可使其全部失活；5mmol/L KCN 可使酶比活力全部喪失；SDS可使降低SOD比活力，且隨SDS含量的增加而明顯降低；0.05% β-巰基乙醇可使大麥蟲(chóng)SOD比活力嚴(yán)重喪失；5mol/L尿素對(duì)大麥蟲(chóng)SOD比活力無(wú)明顯影響，說(shuō)明低濃度的尿素對(duì)酶的分子結(jié)構(gòu)影響不大，但加入含0.5%EDTA的5mol/L尿素，可使酶比活力完全抑制，可見(jiàn)金屬輔基對(duì)SOD比活力穩(wěn)定起重要作用；大麥蟲(chóng)SOD受氯仿-乙醇混合液的的影響較小，因此可以判斷出大麥蟲(chóng)SOD為Cu,Zn-SOD。

2.6 大麥蟲(chóng)SOD分子質(zhì)量

圖4 大麥蟲(chóng)SOD的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of purified SOD from Zophobas morio L. larvae

由圖4可知，大麥蟲(chóng)中分離純化的SOD經(jīng)SDS-PAGE得到兩條電泳帶，其中一條帶子質(zhì)量為19.18kD，另一條帶分子質(zhì)量為37.30kD；樣品緩沖液中2% SDS可使SOD的亞基發(fā)生部分解聚而呈現(xiàn)出兩條帶，說(shuō)明大麥蟲(chóng)SOD由兩個(gè)相同的亞基構(gòu)成。

2.7 大麥蟲(chóng)SOD的光譜性質(zhì)

圖5 大麥蟲(chóng)SOD的紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of SOD from Zophobas morio L. larvae

本實(shí)驗(yàn)使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)經(jīng)Sephadex G-75純化的大麥蟲(chóng)SOD在200～400nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖5所示，該酶的紫外吸收峰在278nm。

2.8 大麥蟲(chóng)SOD的金屬原子含量鑒定

經(jīng)測(cè)定，大麥蟲(chóng)SOD中Cu、Zn、Fe以及Mn的含量分別為Cu 3569.84mg/kg、Zn 3606.86mg/kg、Fe 190.3mg/kg、Mn 3.664mg/kg，計(jì)算得出每個(gè)大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)SOD分子包含2.08個(gè)Cu原子，2.06個(gè)Zn原子；而Fe、Mn原子的含量極微。因此可以根據(jù)大麥蟲(chóng)SOD分子中含有的金屬原子的種類(lèi)及數(shù)量確定大麥蟲(chóng)SOD的類(lèi)型為Cu,Zn-SOD。

3 結(jié) 論

本研究采用DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析等純化方法獲得了酶比活力較高的大麥蟲(chóng)SOD，其比活力為7044.61U/mg，純化倍數(shù)為68.54倍；經(jīng)鑒定該酶為Cu,Zn-SOD，其分子質(zhì)量為37.30kD，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的Cu, Zn-SOD的分子質(zhì)量(30～39kD)相當(dāng)。該酶在278nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰，這與文獻(xiàn)報(bào)道的Cu, Zn-SOD的紫外吸收峰在250～270nm之間稍有差異，可能是大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)SOD含有一定量的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所致，因此對(duì)大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)SOD的氨基酸種類(lèi)及含量有待進(jìn)一步研究。

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Purification and Characterization of Superoxide Dismutase from Zophobas morio L. Larvae

ZHANG Jian-xin，LIU Na，HE Gui-mei，GUO Qian
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: To explore the purification and properties of superoxidae dismutase (SOD) from Zophobas morio L. larvae. Methods: SOD were obtained from Zophobas morio L. larvae by salting-out, DEAE-Sepharose FF column chromatography and Sephadex G-75 column chromatography. SDS-PAGE was used to determine its molecular weight and atomic absorption spectrometer was used to identify it types. Results: SOD with highly specific activity was obtained. The purification factor was 68.54. The purified SOD was identified as Cu, Zn-SOD with molecular weight of 37.30 kD. It had an absorption peak at 278 nm and good stability. Its optimal temperature and pH were 40 ℃ and 6.0, respectively. Its high sensitivity to H2O2 and βmercaptoethanol was found , while a mixture of CHCl3and CH3CH2OH (3:5, V/V) had little effect on its activity. Conclusion: The SOD extracted from Zophobas morio L．larvae has high enzymatic activity, stability and application potential.

Zophobas morio L.；SOD；purification；characterization

Q969.481.1

A

1002-6630(2012)11-0215-04

2011-06-03

張建新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)安全與標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：zhangjx59@foxmail.com