趙海霞，李成磊，白悅辰，陳 惠，吳 琦*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

苦蕎類異黃酮還原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

趙海霞，李成磊，白悅辰，陳 惠，吳 琦*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

利用RT-PCR技術(shù)，從苦蕎(Fagopyrum tatarium)中克隆得到類異黃酮還原酶基因(IRL)的開放閱讀框序列(ORF)，命名為FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一個(gè)長(zhǎng)942bp的ORF，編碼313個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與金蕎異黃酮還原酶FcIFR (GenBank登錄號(hào)ABV02071)同源性最高，達(dá)到97%；與其他植物IRL同源性為44%～73%。生物信息學(xué)分析表明：FtIRL推導(dǎo)的蛋白質(zhì)含有典型的底物結(jié)合口袋和保守的NADPH結(jié)合位點(diǎn)，符合短鏈脫氫酶家族的結(jié)構(gòu)特征。構(gòu)建基于氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，苦蕎FcIFR雖然在氨基酸序列上與其他植物的異黃酮還原酶(IFR)有較高的同源性，但其生物學(xué)功能可能更接近落葉松脂醇還原酶(PLR)。

苦蕎；類異黃酮還原酶；基因克??；序列分析

苦蕎(Fagopyrum tatarium)也稱韃靼蕎麥，屬蓼科植物，原產(chǎn)于我國(guó)及印度等地，在我國(guó)主要分布在西南山區(qū)、云貴高原及陜西和山西等地。隨著經(jīng)濟(jì)和科學(xué)的發(fā)展，以及對(duì)苦蕎營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的深入研究，對(duì)苦蕎的利用和開發(fā)也越來越受到重視[1]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)《本草綱目》記載，苦蕎性味苦、平寒，有益氣力、續(xù)精神、利耳目和降氣寬腸健胃的作用。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)表明，食用苦蕎及其制品可顯著降低人體血液中的膽固醇和血糖含量，對(duì)高血壓、冠心病和中風(fēng)等病人都有輔助療效作用，對(duì)糖尿病有良好的治療和緩解作用。這些作用都與苦蕎中富含的黃酮類物質(zhì)有關(guān)[2]。

異黃酮還原酶(isoflavone reductase，IFR)、落葉松脂醇還原酶(pinoresinol-lariciresinol reductases，PLR)和苯基香豆?jié)M芐醚還原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase，PCBER)是合成木質(zhì)素(lignans)和異黃酮(isoflavone)等植物次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，是具有NADPH依賴性的芳香族還原酶[3]，屬于同源性較高的短鏈脫氫酶家族(short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)成員[4]。由于對(duì)IFR、PLR和PCBER各成員生物學(xué)功能和反應(yīng)機(jī)制的了解還比較有限，學(xué)界將其統(tǒng)一稱為類異黃酮還原酶(isoflavone reductase-like，IRL)[5-6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IRL參與了植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答[7]，與植物中多種抗毒素的合成密切相關(guān)，例如紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsIFR是合成美迪紫檀素(medicarpin)的關(guān)鍵酶[8]。本研究以苦蕎為材料，克隆編碼苦蕎IRL的cDNA序列，為進(jìn)一步研究苦蕎黃酮類化合物的合成表達(dá)調(diào)控與其抗逆生理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：“西蕎二號(hào)”購自四川西昌學(xué)院。

Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、克隆載體pMD19-T 日本TaKaRa公司；RNA提取試劑植物RNAout試劑盒 天澤基因工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 加拿大Fermentas公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

苦蕎花蕾總RNA提取所需器皿均按RNA操作常規(guī)方法處理。以植物RNAout試劑盒提取苦蕎花蕾總RNA，電泳檢驗(yàn)其完整性并置于液氮中保存。

1.2.2 RT-PCR制備cDNA第一鏈

依次向200μL PCR管中加入苦蕎花總RNA 4μL、引物Oligo-dT (10μmol/L) 1μL、DEPC H2O 7μL，溫和混勻后，70℃變性5min，立即置于冰上。向上述PCR管中加入5×Reaction Buffer 4μL、RiboLockTMRiobonuclease Inhibitor 1μL、dNTP Mix (10mmol/L) 2μL，37℃反應(yīng)5min除去可能的RNA酶污染。上述PCR管中加入1μL RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase，反應(yīng)總體積20μL。42℃反應(yīng) 60min；70℃條件下10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，將合成的cDNA第一鏈保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 苦蕎IRL基因開放閱讀框序列(ORF)的克隆

根據(jù)NCBI上已經(jīng)發(fā)表的金蕎(Fagopyrum cymosum)異黃酮還原酶基因序列(GenBank登錄號(hào)EU116032)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物IRL-f和IRL-r。上游引物IRL-f包含基因的起始密碼ATG，序列為：5＇-GATGGCAAAGGGCAAGG TG-3＇(下劃線為起始密碼)；下游引物IRL-r位于基因的3＇AUTR區(qū)域，序列為：5＇-GCTCGCTCAAGAAAGGGGT-3＇。

苦蕎類異黃酮還原酶基因cDNA的PCR反應(yīng)體系：ddH2O 34μL、10×Buffer 5μL、25mmol/L MgCl23μL、dNTP mixture 3μL、20μmol/L上下游引物各1.5μL、模板cDNA 1μL、Taq DNA聚合酶1μL (5U/μL)，總體積50μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸150s，共30個(gè)循環(huán)；72℃保溫8min。利用膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增片段并克隆到pMD 19-T載體，篩選陽性轉(zhuǎn)化子送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.4 苦蕎IRL的生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果采用http://genes.mit.edu/GENSCAN.html和http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic進(jìn)行序列比對(duì)分析。采用http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/和http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列和亞細(xì)胞定位。采用SWISSS MODEL (http:// swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三維建模。采用用軟件MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎花總RNA的提取及其IRL基因ORF的擴(kuò)增

圖1 苦蕎花總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from F. tataricum

圖2 苦蕎IRL基因ORF的擴(kuò)增Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of IRL ORF from F. tataricum

由圖1苦蕎花總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可知，28S RNA和18S RNA的條帶清晰可見，亮度比接近2:1，RNA完整性較好。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，使用引物IRL-f和IRL-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖2可知，擴(kuò)增得到一條約1.2kb的特異條帶。

2.2 FtIRL的序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆并測(cè)序后，得到長(zhǎng)度為1081bp的核苷酸序列，包含引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)IRL-f和IRL-r，將該序列命名為FtIRL。http://genes.mit.edu/GENSCAN.html網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)tIRL包含1個(gè)長(zhǎng)度為942bp的完整ORF，編碼313個(gè)氨基酸；含有植物黃酮類化合物合成相關(guān)基因典型起始序列ATGGCA[9]；終止密碼TAG后含有一段138bp的3＇-UTR。將FtIRL推導(dǎo)的氨基酸序列提交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果表明FtIRL的氨基酸序列與FcIFR(GenBank登錄號(hào)ABV02071)同源性最高，達(dá)到97%；與其他植物IRL同源性為44%～73%之間，表明成功克隆苦蕎FtIRL的cDNA序列。

將FtIRL的氨基酸序列提交應(yīng)用蛋白質(zhì)組分析工具(http://www.expasy.org/tools/#proteome)，推測(cè)FtIRL蛋白總的原子數(shù)為5008個(gè)，理論分子質(zhì)量為35.23kD，pI值為6.20；蛋白質(zhì)中極性氨基酸含量為33.55%，疏水氨基酸含量為 36.10%。采用SignalP 3.0 (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)對(duì) FtIRL蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，沒有發(fā)現(xiàn)分泌途徑信號(hào)肽(S P)、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(cTP)以及線粒體靶肽(mTP)，表明FtIRL蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)[10]。

圖3 FtIRL的ORF序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 DNA sequence of ORF of FtIRL gene and deduced amino acid sequence of FtIRL protein

2.3 FtIRL二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA(self-optimized prediction method from alignment)程序進(jìn)行FtIRL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖4可知，F(xiàn)tIRL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其中α-螺旋占39.30% (12個(gè)較大的α-螺旋，6個(gè)較小的α-螺旋)，β-折疊為17.25%(14個(gè)β-折疊)，β-轉(zhuǎn)角為9.27%(15個(gè)β-轉(zhuǎn)角)以及34.19%的無規(guī)則卷曲。FtIRL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與紫花苜蓿MsIFR和金葉連翹FiPLR蛋白的高度相似，三者在二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的含量和部位上差異較小，為其形成活性中心和行使相應(yīng)的生物學(xué)功能提供了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖4 FtIRL二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Deduced secondary structure of FtIRL protein

2.4 FtIRL三維結(jié)構(gòu)建模

圖5 FtIRL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Deduced 3-D structure of FtIRL protein

進(jìn)入Swiss-Model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器，將所得PDB文件用Spdbv37sp5軟件進(jìn)行瀏覽和編輯，見圖5。FtIRL蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，與金葉連翹FiPLR三維結(jié)構(gòu)高度相似：較大的結(jié)構(gòu)域約N端約200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，負(fù)責(zé)與IRL蛋白的輔助因子NADPH結(jié)合；較小的結(jié)構(gòu)域由C端約100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，形成IRL蛋白的底物結(jié)合口袋。FtIFR蛋白具有SDR家族的典型特征，其N端和C端聚集在活性中心口袋周圍，而其活性中心口袋較紫花苜蓿MsIFR狹窄且與FiPLR更為接近。在氨基酸組成上，F(xiàn)tIFR的活性中心有較大的可變性，由F164、V266和A271構(gòu)成，而FiPLR蛋白活性中心由F164、V268和L271構(gòu)成，其中F164氨基酸殘基在所有的IFR、IRL和PLR中高度保守。這在一定程度上解釋了IRL、PLR和PCBER等SDR家族成員雖然在氨基酸序列上高度相似，但其生物學(xué)功能確各有差異的原因。

2.5 分子進(jìn)化分析

圖6 不同植物IRL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of IRL protein in different plants

NCBI數(shù)據(jù)庫中IFR相關(guān)的數(shù)據(jù)較少，在有花植物中主要有IFR、IRL和PLR三類酶蛋白基因共150多條相關(guān)序列。采用MEGA4.0軟件[11]，通過鄰接法構(gòu)建基于有花植物中13個(gè)物種IRL相關(guān)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖6可知，同為蓼科植物的FtIRL與金蕎FcIFR同源關(guān)系最近，且和木犀科的金葉連翹PLR聚為一大類(Cluster Ⅰ)；其他植物的IFR和IRL聚為一大類，其中雙子葉植物聚為Cluster ⅡA，單子葉植物聚為Cluster ⅡB。多數(shù)植物的IRL在進(jìn)化上較為保守，符合植物分類規(guī)律。苦蕎和金蕎雖然在氨基酸序列上與其他植物的IFR相關(guān)基因有較高的同源性，但其生物學(xué)功能可能更接近PLR。

3 討 論

在中國(guó)、日本和韓國(guó)等亞洲國(guó)家，苦蕎作為一種具有保健價(jià)值的糧食作物日益受到關(guān)注[12]。黃酮類化合物的含量是衡量苦蕎品質(zhì)高低的標(biāo)準(zhǔn)之一。異黃酮類化合物主要分布于豆科植物中(Leguminosae)[13]，但苦蕎中的黃酮類化合物是以蘆丁為代表的黃酮醇類物質(zhì)及其衍生物，目前還未見從苦蕎中分離出異黃酮的報(bào)道。本研究以苦蕎黃酮類化合物含量最高的花蕾為材料，采用RT-PCR技術(shù)獲得了FtIRL，但卻未能從甜蕎中獲得與IRL類似的序列。通過序列分析，F(xiàn)tIRL與高黃酮含量的金蕎愈傷組織中分離的FcIFR在基因的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)上同源性較高，表明二者編碼的蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果和基于氨基酸序列的分子進(jìn)化結(jié)果均進(jìn)一步表明，F(xiàn)tIRL在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上更加接近PLR。

苦蕎和金蕎中的黃酮類化合物的合成存在著不同的分支途徑，隨著各分支途徑的代謝的強(qiáng)弱不同，相關(guān)基因的表達(dá)豐度存在一定差異。而苦蕎中FtIRL可能與未直接參與異黃酮的合成過程，很可能作為SDR家族中的成員從而參與其他次生代謝產(chǎn)物的合成反應(yīng)。近年來，隨著對(duì)苦蕎抗逆生理研究的深入，發(fā)現(xiàn)苦蕎中黃酮類化合物含量的上升常常伴隨著逆境的出現(xiàn)[14-16]，這在一定程度上反映了苦蕎中黃酮類化合物的含量與FtIRL表達(dá)豐度之間的潛在關(guān)系。例如：水稻OsIRL在稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)和茉莉酸的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量上升[17]；研究者從西柚中鑒定出IRL基因，該基因在紫外照射和真菌浸染時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)[18]；咖啡葉中CoIRL在真菌浸染和機(jī)械損傷的逆境下，表達(dá)量顯著上升[7]。

植物黃酮的生物合成，是由不同的基因所編碼的酶控制并以代謝流的方式流向不同的支路，從而形成了種類多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的植物黃酮及其衍生物。FtIRL作為苦蕎SDR中的IRL類基因，其生物學(xué)功能還不甚明晰，與苦蕎中黃酮類化合物生物合成的關(guān)系以及對(duì)逆境的應(yīng)答機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，對(duì)苦蕎FtIRL的研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)苯丙烷類代謝途徑中不同基因的表達(dá)機(jī)制以及相應(yīng)代謝產(chǎn)物的生理作用，從而獲得更多與苦蕎品質(zhì)相關(guān)的功能基因，為高黃酮苦蕎轉(zhuǎn)基因育種提供實(shí)驗(yàn)素材。

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Cloning and Sequence Analysis of the Isoflavone Reductase-like (FtIRL) Gene from Fagopyrum tatarium

ZHAO Hai-xia，LI Cheng-lei，BAI Yue-chen，CHEN Hui，WU Qi*
(College of Life and Basic Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The cDNA sequence of isoflavone reductase-like gene IRL from Fagopyrum tataricum was amplified by RT-PCR. Sequencing showed that the ORF of IRL gene from F. tataricum (named as FtIRL) was 942bp, probably encoding a protein of 313 amino acids. Further analysis indicated that the deduced FcIFR protein had homology values of 97% with other plants,IRLs. FtIRL possessed two short-chain dehydrogenase/reductase conserved motifs: a substrate-binding pocket and a NADPH binding site. The phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences indicated that, although the amino acid sequence of IRL gene from F. tataricum had high homology with that of isoflavone reductase (IFR) genes from other plants, its biological function might be more similar to that of pinoresinol lariciresinol reductase (PLR).

Fagopyrum tataricum；isoflavone reductase-like protein；gene cloning；sequence analysis

Q943.2；S517.032

A

1002-6630(2012)11-0210-05

2011-07-04

趙海霞(1977—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)榛蚬こ?。E-mail：aasky8@163.com

*通信作者：吳琦(1973—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn