陳今朝，王劍鋒*，王慧超，譚永忠

(1.長江師范學院生命科學與技術學院，重慶 408100；2東華理工大學生物系，江西 撫州 344000)

熱穩(wěn)定酸性β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學性質

陳今朝1，王劍鋒2,*，王慧超1，譚永忠1

(1.長江師范學院生命科學與技術學院，重慶 408100；2東華理工大學生物系，江西 撫州 344000)

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌絲體破碎液依次經過乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過濾等步驟處理，獲得電泳純的β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE顯示其分子質量為125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最適pH值為3.0～4.0，最適溫度為70℃，表觀米氏常數(Km)值為2.35mmol/L，表觀kcat/Km值為2.99×104L/(mol·s)；水解京尼平苷、水楊苷的表觀kcat/Km值分別是1.26×104、1.37×104L/(mol·s)；水解活性受Mn2+的顯著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等離子的微弱抑制。該酶活性在pH2.0～8.3保持穩(wěn)定；酶在65℃時保溫60min，殘余酶活達到了85%，是一種熱穩(wěn)定酸性β-葡萄糖苷酶。

胞內酶；乙醇沉淀；對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷；京尼平苷；β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)是纖維素完全酶解糖化的限速酶種[1]；具有水解和糖基轉移活性，底物專一性較差，對多種糖苷類物質均有較強的催化活性[2]。因而，BGL在纖維素生物煉制和藥食資源開發(fā)利用等領域具有廣泛的應用價值，如用于低聚龍膽糖的生產[3]、紅景天苷等糖苷類活性物質的酶法合成[4-5]和轉化天然產物中的糖苷類物質[6]，從而改善和提高果蔬茶的風味及中草藥的藥理活性。黑曲霉是常見的BGL產酶菌種，也是食藥生產領域公認的安全菌株。本實驗室從霉爛的梔子果上分離到一株能水解京尼平苷的黑曲霉菌株Aspergillus niger L.，該菌株具有較強的耐酸性，在培養(yǎng)基初始pH1.5時，仍能正常產酶；該菌株可以產生兩種胞外酸性BGL，它們的最適反應pH值均為2.5，其他酶學性質也顯著區(qū)別于他種菌株來源的BGL[7]。本實驗對Aspergillus niger L. 菌絲進行了破碎抽提，從中制備了一種電泳純的BGL，并對其酶學性質進行了實驗分析，為進一步開發(fā)利用Aspergillus niger L.源BGL提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑曲霉Aspergillus niger L.為實驗室分離自霉變梔子果。

DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100 美國Pharmacia公司；蛋白質分子量標準 上海生工生物工程技術服務有限公司；考馬斯亮藍R-250、聚乙二醇20000(PEG-20000)、對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、3,5-二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團化學試劑有限公司；其余化學試劑均為分析純。

UV-1600紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；QT-2H自動液相色譜分離層析儀(配有N2000色譜數據工作站) 上海琪特分析儀器有限公司；DYCZ-3 型電泳槽、DYY-4C 型電泳儀 北京六一儀器廠；GL-21MC立式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；JYD-900超聲波細胞破碎機 上海之信儀器有限公司。

1.2 BGL的制備與分離

1.2.1 BGL的制備

Aspergillus niger L.孢子接種在豆渣培養(yǎng)基中28℃、180r/min培養(yǎng)5d；發(fā)酵醪液經絲網過濾收集菌絲體，菌絲體用蒸餾水洗滌多次并壓干水分，然后將菌絲體分散在適量pH8.0、100mmol/L Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎，超聲功率800W、時間20min、破碎3s、暫停3s，后將菌絲破碎液于12000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 BGL的分離

取一定體積冷藏粗酶液，加入1.25倍體積-20℃乙醇混勻，冷凍離心得沉淀；沉淀以少量pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解，上柱DEAE-Sepharose FF、洗柱至基線平直，用同樣緩沖液配制的0～0.4mol/L NaCl溶液400mL線性梯度洗脫，洗脫流速90mL/h，每5.0mL收集一管，檢測與280nm波長處光吸收峰相對應各管的酶活力和純度。收集各管酶液于透析袋中并用PEG-20000包埋濃縮；濃縮酶液進行凝膠過濾Sephadex G-100，pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速10mL/h，每3.0mL收集一管，檢測蛋白峰各管酶活力。

1.3 指標的測定

1.3.1 蛋白質濃度的測定

依據Bradford法[8]測定蛋白質濃度。

1.3.2 SDS-PAGE[9]

SDS-PAGE條件：濃縮膠4%、分離膠10%，染色劑：考馬斯亮藍R-250。

1.3.3 BGL活性的測定[7]

采用pNPG法和DNS法分別測定BGL的活性。

1.3.4 酶的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性的測定

在不同溫度下pNPG法測定酶活力，以酶活力最高時的反應溫度為最適反應溫度；酶液在不同溫度下分別水浴保溫20、40、60min后測定酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%，比較不同溫度條件下的相對酶活力。

1.3.5 酶的最適反應pH值及pH值穩(wěn)定性的測定

在不同pH值的緩沖液中按照pNPG法測定酶活力，以酶活最高時的反應pH值為最適反應pH值；將酶液用不同pH值的緩沖液同等倍數稀釋，25℃水浴保溫12h，測定相對酶活力。

1.3.6 無機離子對酶活力的影響

在含待考察離子10mmol/L的酶促反應體系中以pNPG為底物測定酶活力，以去離子水透析的酶液的酶活力為100%。

1.3.7 酶促動力學參數測定

在65℃、pH4.0、100mmol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液中酶液與不同濃度底物反應，用Linewear-Burk作圖法求出酶水解底物的米氏常數(Km)、最大反應速率(Vmax)，測定酶蛋白量計算酶的底物轉換數(kcat)。

1.4 數據分析

采用統計軟件DPS v3.01專業(yè)版，SSR檢驗顯著性水平α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 Aspergillus niger L.胞內β-葡萄糖苷酶的分離與純化

圖1 β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of BGL from Aspergillus niger L.

菌絲體經超聲破碎抽提獲得BGL75.2U/g(以菌絲干質量計)。粗酶液分別用PEG-6000(20mg/100mL)、(NH4)2SO490%飽和度沉淀濃縮，酶活回收率分別為14%和81%，顯示胞內BGL與胞外BGL在溶解性上存在顯著差異。粗酶液依次經過乙醇沉淀、D EA E-Seph arose FF、Sephadex G-100柱層析(表1)，獲得了電泳純的BGL，SDS-PAGE圖譜(圖1)顯示BGL的分子質量為125.7kD。

表1 β-葡萄糖苷酶的分離純化Table 1 Purification of BGL from Aspergillus niger L.

2.2 Aspergillus niger L.胞內BGL的酶學性質

2.2.1 pH值對BGL活性及穩(wěn)定性的影響

圖2 pH值對β-葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on BGL activity

由圖2可知，在pH值2.0～6.5的范圍內，BGL對pNPG均有明顯的水解活性，其中pH值為3.0～4.0時，酶的水解活性最高；此外，酶的水解活性隨pH值變化而下降，pH值由3.0下降至2.0時，酶活下降了66%，而pH值由4.0上升至5.0時，酶活下降了30%，說明在較低的pH值范圍內，酶活力對酸度的變化更明顯。25℃保溫12h后，BGL殘余酶活力在pH2.0～8.3的范圍內穩(wěn)定，說明胞內BGL具有很好的pH值穩(wěn)定性。

2.2.2 溫度對BGL活性及穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on BGL activity

圖4 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Combined effects of temperature and incubation time on BGL stability

表2 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 2 Effects of inorganic ions on BGL activity as tested using pNPG as substrate

由圖3可知，BGL在30～80℃均有水解活性，最適作用溫度為70℃，但反應溫度高于70℃時，相對酶活力急劇下降，80℃時的反應活性與30℃時的活性相當。由圖4可知，在65℃保溫60min，相對酶活力為85%，而在70℃保溫60min，相對酶活力僅為14%，因此，胞內BGL有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 金屬離子對BGL活性的影響

由表2可知，BGL水解pNPG的活性受不同金屬離子(10mmol/L)的影響。Mn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+、Na+、Hg+等離子激活BGL水解活性，其中以Mn2+的作用最為顯著；Cu2+、Zn2+、Fe2+等抑制酶活性，Fe2+的抑制作用較明顯；K+和Ca2+對酶活性則無明顯影響。

2.2.4 BGL的底物特異性及催化效率

在pH4.0、65℃的反應條件下，依據Linewear-Burk作圖法分別以pNPG、京尼平苷、水楊苷為底物測定BGL的Km、kcat(表3)。依專一性常數kcat/Km可知，胞內BGL水解pNPG的催化效率是京尼平苷、水楊苷的兩倍多，而水解后兩者的催化效率相當，因此，pNPG是胞內BGL的最適底物；同時也說明BGL對β-葡萄糖苷的苷元物質具有選擇性。

表3 β-葡萄糖苷酶的動力學參數Table 3 Km and kcat values of BGL for three specific substrates

3 討 論

微生物源BGL的分子質量、酶學性質因菌種、菌株不同而有較大差異，其適用范圍也隨之不同。BGL的分子質量一般介于40～250kD，多數在70～138kD；最適反應pH值為3.5～7.0，以pH4.0～6.0常見；pH值穩(wěn)定范圍多在pH4.0～8.0；最適反應溫度常為55℃，部分為65～70℃；熱穩(wěn)定范圍常小于60℃[1,10-22]。Aspergillus niger L.株胞內BGL的分子質量為125.7kD，最適反應溫度、pH值分別為70℃、3.0～4.0，pH值穩(wěn)定范圍為pH2.0～8.3，65℃保溫60min，相對酶活力保留85%，除分子質量與Aspergillus niger NL-1胞內BGL(122.7kD)[14]接近外，最適反應溫度、pH值、pH值穩(wěn)定范圍和熱穩(wěn)定溫度均明顯不同于后者(60℃、5.0、3.0～6.0、60℃)，也區(qū)別于實驗菌株產生的胞外BGL(55℃、2.5、2.0～7.0，55～60℃)[7]；因此，該酶是一種耐酸耐熱的BGL，它的分子質量和最適反應pH值與Penicillium pinophilum[11]Penicillium purpurogenum[16]等來源的BGL相近，最適反應溫度與Penicillium decumbens[1]、 Penicillium citrinum[19]、Periconia sp.[20]、Fomitopsis palustris[22]等來源的BGL相同，熱穩(wěn)定性優(yōu)于Termitomyces clypeatus來源的BGL(60℃保溫1h，殘余酶活80%)[13]，而不及Periconia sp.來源的BGL(70℃保溫1.5h，殘余酶活60%)[20]。

BGL的水解專一性較差，能作用于所有的葡萄糖β-二聚物；作用于β-1,4、β-1,1、β-1,2、β-1,3和β-1,6連鍵；裂解C-O糖苷鍵、C-S鍵、C-N鍵和C-F鍵等；有些能水解β-葡萄糖苷、β-半乳糖苷，甚至木糖苷[2]。實驗菌株胞內BGL對鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷無水解活性，區(qū)別于其胞外BGL，說明該酶底物專一性高于胞外BGL，對底物的糖苷鍵構型和糖基種類均具有選擇性。底物專一性常數kcat/Km顯示，該BGL對pNPG、水楊苷和京尼平苷等β-D-吡喃葡萄糖苷均有催化活性，pNPG是其天然底物，水解京尼平苷和水楊苷的催化效率相當且遠低于pNPG，表明胞內BGL的催化效率受底物分子中苷元結構的影響，而胞外兩種BGL的天然底物是京尼平苷，其對京尼平苷的催化效率(kcat/Km分別為4.28×104L/(mol·s)和1.04×105L/(mol·s))[7]也遠高于胞內BGL；并且胞內BGL對pNPG的催化效率高于未培養(yǎng)源BGL1T[12]和源于Penicillium citrinum的嗜酸熱BGL[19]。胞內BGL的催化活性也受金屬離子的明顯影響，受Mn2+的顯著激活，受Fe2+、Zn2+、Cu2+等的抑制，但受抑制強度顯著弱于胞外BGL1。

Aspergillus niger L. 菌株胞內BGL具有耐酸耐熱、專一性較強、催化活性高且受金屬離子影響小等特點，其酶學性質顯著優(yōu)于他種來源的β-葡萄糖苷酶，適用于橙汁脫苦、中草藥活性成分轉化、纖維素酶解糖化等酸性高溫的工業(yè)應用環(huán)境。

[1]CHEN Mei, QIN Yuqi, LIU Ziyong, et al. Isolation and characterization of a β-glucosidase from Penicillium decumbens and improving hydrolysis of corncob residue by using it as cellulase supplementation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2010, 46(6): 444-449.

[2]孟憲文, 宋小紅, 陳歷俊, 等. β-葡萄糖苷酶的研究進展[J]. 中國乳業(yè), 2009(10): 42-44.

[3]劉玲玲, 朱松, 朱婷, 等. 重組β-葡萄糖苷酶生產龍膽低聚糖的工藝條件優(yōu)化[J]. 微生物學報, 2009, 49(5): 597-602.

[4]劉璘, 梅樂和, 柳行, 等. 酶催化制備 p-羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷過程強化[J]. 高?；瘜W工程學報, 2009, 23(1): 87-91.

[5]王夢亮, 李萬麗. 固定化β-葡萄糖苷酶催化合成紅景天甙的研究[J].生物技術, 2009, 19(1): 68-70.

[6]金鳳燮, 莊子瑜, 魚紅閃, 等. 特異的中草藥配糖體苷酶微生物及其發(fā)酵與酶學特性[J]. 生物工程學報, 2009, 25(12): 1863-1870.

[7]王劍鋒, 陳今朝, 梁華正, 等. 黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學性質[J]. 菌物學報, 2010, 29(5): 683-690.

[8]李建武, 袁明秀. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京: 北京大學出版社, 2000: 89-130.

[9]郭堯君. 蛋自質電泳實驗技術[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 161-191.

[10]GAO Juan, ZHAO Xuesong, LIU Haibo, et al. A highly selective ginsenoside Rb1-hydrolyzing β-D-glucosidase from Cladosporium fulvum[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(6): 897-903.

[11]JOO A R, JEYA M, LEE K M, et al. Production and characterization of β-1,4-glucosidase from a strain of Penicillium pinophilum[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(6): 851-858.

[12]JIANG Chengjian, HAO Zhenyu, JIN Ke, et al. Identification of a metagenome-derived β-glucosidase from bioreactor contents[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 63(1/2): 11-16.

[13]PAL S, BANIK S P, GHORAI S, et al. Purification and characterization of a thermostable intra-cellular β-glucosidase with transglycosylation properties from filamentous fungus Termitomyces clypeatus[J]. BioresourceTechnology, 2009, 101(7): 2412-2420.

[14]趙林果, 夏文靜, 游麗金, 等. 黑曲霉胞內β-葡萄糖苷酶分離提純及其性質的研究[J]. 現代化工, 2008, 28(10): 38-42.

[15]NAZ S, IKRAM N, RAJOKA M, et al. Enhanced production and characterization of a β-glucosidase from Bacillus halodurans expressed in Escherichia coli[J]. Biochemistry, 2010, 75(4): 513-518.

[16]JEYA M, JOO A R, LEE K M, et al. Characterization of β-glucosidase from a strain of Penicillium purpurogenum KJS506[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86(5): 1473-1484.

[17]NASCIMENTO C V, SOUZA F H, MASUI D C, et al. Purification and biochemical properties of a glucose-stimulated β-D-glucosidase produced by Humicola grisea var. thermoidea grown on sugarcane bagasse [J]. Journal of Microbiology, 2010, 48(1): 53-62.

[18]SOUZA F H M, NASCIMENTO C V, ROSA J C, et al. Purification and biochemical characterization of a mycelial glucose- and xylose-stimulated β-glucosidase from the thermophilic fungus Humicola insolens [J]. Process Biochemistry, 2010, 45(2): 272-278.

[19]NG I S, LI Chenwei, CHAN Shuangpi, et al. High-level production of a thermoacidophilic β-glucosidase from Penicillium citrinum YS40-5 by solid-state fermentation with rice bran[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(4): 1310-1317.

[20]HARNPICHARNCHAI P, CHAMPREDA V, SORNLAKE W, et al. A thermotolerant β-glucosidase isolated from an endophytic fungi, Periconia sp., with a possible use for biomass conversion to sugars[J]. Protein Expression and Purification, 2009, 67(2): 61-69.

[21]KOROTKOVA O, SEMENOVA M, MOROZOVA V, et al. Isolation and properties of fungal β-glucosidases[J]. Biochemistry, 2009, 74(5): 569-577.

[22]YOON J J, KIM K Y, CHA C J. Purification and characterization of thermostable β-glucosidase from the brown-rot basidiomycete Fomitopsis palustris grown on microcrystalline cellulose[J]. Journal of Microbiology, 2008, 46(1): 51-55.

Purification and Characterization of Thermostable Acidic β-Glucosidase from Aspergillus niger L.

CHEN Jin-zhao1，WANG Jian-feng2,*，WANG Hui-chao1，TAN Yong-zhong1
(1. Life Science and Technology Institute, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China ；2. Department of Biology, East China Institute of Technology, Fuzhou 344000, China)

In this study, an acidic β-glucosidase (BGL) was purified from acid-tolerant Aspergillus niger L. mycelia by ethanol precipitation, DEAE-Sepharose column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. SDS-PAGE showed that the molecular weight of the enzyme was 125.7 kD. Further characterization revealed that it had maximal hydrolytic activity on p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) at pH 3.0 — 4.0 and 70 ℃ with a Kmof 2.35 mmol/L and a kcat/Kmof 2.99 × 104mol/L·s. The kcat/Km values for hydrolyzing geniposide and salicin were 1.26 × 104L/(mol·s) and 1.37 × 104L/(mol·s), respectively. The hydrolytic activity was activated obviously by Mn2+but inhibited faintly by Fe2+, Zn2+and Cu2+. The BGL was highly stable at pH 2.0 — 8.5, and 85% of its original activity could be maintained after 60 min of heat treatment at 65 ℃. Thus, the enzyme was highly stable to heat.

intracellular enzyme；ethanol precipitation；p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside；genipin；βglucosidase

Q939.97

A

1002-6630(2012)11-0205-05

2011-06-03

重慶市科技攻關計劃項目(CSTC，2011AC1004)

陳今朝(1964—)，男，副教授，碩士，研究方向為微生物工程。E-mail：chenjinzhao@126.com

*通信作者：王劍鋒(1968—)，男，講師，碩士，研究方向為微生物工程。E-mail：wangjianfeng68@126.com