周 佳，劉書亮*，胡欣潔，張?jiān)?/p>

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

產(chǎn)寬譜pH細(xì)菌素乳酸菌的篩選鑒定、毒力檢測(cè)及細(xì)菌素特性研究

周 佳，劉書亮*，胡欣潔，張?jiān)?/p>

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

采用瓊脂擴(kuò)散法從分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌中篩選細(xì)菌素產(chǎn)生菌，初篩檢測(cè)發(fā)酵上清液抑菌活性，復(fù)篩排除有機(jī)酸和H2O2干擾，檢測(cè)蛋白酶敏感性，測(cè)定抑菌物質(zhì)鹽析液和粗提液抑菌活性，確定菌株SAU-2為細(xì)菌素產(chǎn)生菌。根據(jù)形態(tài)、生理生化指標(biāo)和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為Enterococcus。腸球菌SAU-2溶血素表型陰性，agg、gelE、cylM、cylB、cylA、esp、efaAfm、cpd、cob、ccf、cyILL、cyILS、fsrB和hyLEfm等毒力因子基因型陰性，表明腸球菌SAU-2是安全的。所產(chǎn)細(xì)菌素可耐受121℃條件20min；在pH2.0～12.0有抑菌活性；對(duì)胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，對(duì)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感；主要對(duì)近緣乳酸菌和G+細(xì)菌有抑菌活性，除對(duì)1株銅綠假單胞菌和1株紅酵母有抑菌活性外，對(duì)其余G-細(xì)菌和真菌無抑制作用。

奶渣；腸球菌；細(xì)菌素；毒力因子；特性

乳酸菌素是“公認(rèn)安全(GRAS)”的乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類有抑菌活性的多肽或前體多肽，其不僅對(duì)親緣關(guān)系較近的乳酸菌產(chǎn)生抑制，還對(duì)其他G+菌有一定抑制作用[1]。因其具有安全、高效、無殘留、無毒副作用和無耐藥性等特點(diǎn)，引發(fā)了研究熱潮。迄今已逾百種乳酸菌素被發(fā)現(xiàn)[2]，但廣泛應(yīng)用的乳酸菌素僅有Nisin。而Nisin只在酸性條件下才有抑菌活性，嚴(yán)重限制了它的應(yīng)用。因此，開發(fā)高效、廣譜、穩(wěn)定性良好的乳酸菌素具有重要意義。

產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的來源廣泛[3-10]，但對(duì)我國藏區(qū)和內(nèi)蒙古地區(qū)日常生活的必備食品——奶渣中乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究尚鮮見報(bào)道。目前，對(duì)奶渣的研究還很缺乏。對(duì)奶渣中微生物的研究只停留在分離鑒定酥油奶渣中的乳桿菌[11]。本研究以分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌為實(shí)驗(yàn)材料，篩選產(chǎn)耐酸堿性細(xì)菌素的乳酸菌，并進(jìn)行鑒定；檢測(cè)該菌株的溶血素表型和毒力因子基因型；研究細(xì)菌素的生物學(xué)特性。這不僅可為深入研究細(xì)菌素提供基礎(chǔ)材料，還可為其作為天然食品保鮮劑提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株：分離自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌；指示菌：藤黃微球菌(Micrococcus luteus)10209；抑菌譜測(cè)試菌：9株G+細(xì)菌(4株金黃色葡萄球菌及藤黃微球菌、熱死環(huán)絲菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金桿菌各1株)，13株G-細(xì)菌(2株假單胞菌、7株沙門氏菌、2株大腸桿菌、沙雷氏菌和發(fā)根農(nóng)桿菌各1株)、7株乳酸菌(2株戊糖乳桿菌、2株植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌各1株)，2株酵母菌(紅酵母和啤酒酵母各1株)和5株霉菌(2株米曲霉及黑曲霉、青霉和毛霉各1株)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌培養(yǎng)和發(fā)酵液制備；H2S實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、馬尿酸鹽水解實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)、糖(醇)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等培養(yǎng)基用于乳酸菌鑒定；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于一般細(xì)菌培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)。

胰蛋白酶(250U/mg) 美國Amersco公司；木瓜蛋白酶(6000U/mg)、胃蛋白酶(3000U/mg) 美國Sigma公司；蛋白酶K 德國Merck公司；Bacteria DNA out抽提試劑盒 四川省綿陽天澤基因工程有限公司；R10T1M PCR反應(yīng)試劑、DL2000 DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖 英國Oxoid公司；脫纖維羊血成都奧克公司。

1.3 引物

細(xì)菌鑒定通用引物：正向引物5＇-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇、反向引物5＇-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3＇。擴(kuò)增的腸球菌毒力基因分別為agg(聚合物)、gelE(編碼明膠酶)、cylM(溶血素的轉(zhuǎn)錄后修飾)、cylB(溶血素的運(yùn)輸)、cylA(溶血素的激活)、esp(腸球菌表面蛋白)、efaAfm(屎腸球菌在血清中的細(xì)胞壁黏附素表達(dá))、cpd(性信息素)、cob(性信息素)、ccf(性信息素)、cyILL(溶血素前體)、cyILS(溶血素前體)、fsrB(毒力因子調(diào)節(jié))和hyLEfm(透明質(zhì)酸酶)，其擴(kuò)增引物見表1。以上引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

表1 腸球菌毒力因子擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for virulence factors detection

1.4 儀器與設(shè)備

TE412-L精密電子天平、PB-2B pH計(jì) 德國Sartorius公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；B4i-BR4i冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；1kD透析袋 上海Green Bird公司；游標(biāo)卡尺 成都量具刃具總廠樂興商貿(mào)公司；HJ-3型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；顯微鏡 日本Olympus公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.5 方法

1.5.1 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

將待測(cè)乳酸菌的18h種齡種子液以5%接種量接入MRS肉湯，30℃靜置培養(yǎng)36h，離心收集上清，待用。

1.5.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

初篩采用打孔法檢測(cè)發(fā)酵上清液活性(指示菌終濃度為106CFU/mL)。復(fù)篩排除有機(jī)酸(調(diào)pH值至6.0)和H2O2干擾，檢測(cè)蛋白酶敏感性，具體操作參見文獻(xiàn)[17]。采用牛津杯雙層瓊脂法檢測(cè)鹽析液(硫酸銨沉淀)和粗提液(透析濃縮處理)抑菌活性。鹽析液和粗提液的制備參見文獻(xiàn)[18]，其中所用緩沖液為20mmol/L檸檬酸-磷酸鈉緩沖液(pH6.0)。

1.5.3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

1.5.3.1 菌體形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)

MRS瓊脂平板上觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色后觀察菌體形態(tài)；各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)參照《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]。

1.5.3.216 S rDNA序列分析

以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增待測(cè)菌的16S rDNA片段。PCR反應(yīng)體系：10μmol/L上下游引物各1μL、模板DNA 1μL、2.5U/mL Taq酶 0.5μL、10× PCR Buffer 2.5μL、25mmol/L MgCl21.5μL、dNTP Mixture 2μL、ddH2O補(bǔ)足25μL，設(shè)陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。序列通過Blast在GenBank中進(jìn)行同源性分析，選取與該序列相似度高的序列，采用MEGA4軟件的ClustalX2子程序進(jìn)行多序列比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.4 腸球菌的毒力檢測(cè)

1.5.4.1 溶血實(shí)驗(yàn)

具體操作參見文獻(xiàn)[20]。

1.5.4.2 PCR檢測(cè)毒力因子

以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增待測(cè)菌的毒力因子。PCR反應(yīng)體系同1.5.3.2節(jié)。PCR擴(kuò)增條件，參見文獻(xiàn)[12-16]。PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。序列通過Blast在GenBank中進(jìn)行同源性分析。

1.5.5 細(xì)菌素的生物學(xué)特性研究

1.5.5.1 細(xì)菌素對(duì)pH值、溫度和酶的敏感性

用HCl和NaOH將細(xì)菌素發(fā)酵上清液、鹽析液和粗提液分別調(diào)至pH2.0～12.0，采用牛津杯雙層瓊脂法檢測(cè)抑菌活性。細(xì)菌素樣品分別于60、80、100、115、121℃處理20min后，檢測(cè)抑菌活性。模擬人體內(nèi)環(huán)境條件下，測(cè)定細(xì)菌素發(fā)酵上清液和粗提液的酶敏感性，具體操作參見文獻(xiàn)[18]。粗提液做水浴4h和6h的酶解實(shí)驗(yàn)。于酶最適作用pH值和最適作用溫度下，測(cè)定粗提液的酶敏感性。將其酶解2h后調(diào)回對(duì)照pH6.0，檢測(cè)抑菌活性。

1.5.5.2 抑菌譜測(cè)定

霉菌采用涂布法制備檢測(cè)平板，其他菌株采用傾注法制備檢測(cè)平板。加樣后，置于適宜溫度培養(yǎng)16～48h(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)菌的生長情況而定)，測(cè)定抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

通過打孔法確定34株疑似乳酸球菌中有16株菌的發(fā)酵上清液對(duì)指示菌有抑制作用，產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌株占測(cè)試菌株的47.06%。將16株菌的發(fā)酵上清液調(diào)pH值至6.0后，僅有SAU-2對(duì)指示菌有抑制作用，抑菌圈直徑為9.26mm。菌株SAU-2的發(fā)酵上清液排除H2O2后，抑菌活性無變化。該抑菌物質(zhì)能被胰蛋白酶和蛋白酶K完全降解，確定該抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)。經(jīng)80%飽和度(NH4)2SO4沉淀的鹽析液和粗提液抑菌圈直徑約為17mm，抑菌活性顯著高于發(fā)酵上清液，證明該抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)特性。以上表明菌株SAU-2為細(xì)菌素產(chǎn)生菌。

2.2 菌株SAU-2的鑒定

2.2.1 菌體形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株SAU-2在MRS瓊脂平板上為大小約1mm、露滴狀、光滑、低凸起、邊緣整齊、圓形、無光澤、質(zhì)地松軟、乳白色、不透明菌落；革蘭氏染色顯示其為成對(duì)或成堆排列的G＋球菌。菌株SAU-2的生理生化特征如表2所示。綜合形態(tài)特征及生理生化特征，根據(jù)《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]，初步將菌株SAU-2鑒定為Enterococcus。

表2 菌株SAU-2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of SAU-2

2.2.2 菌株SAU-2基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定

采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast程序比對(duì)菌株SAU-2的16S rDNA序列(登錄號(hào)為JF825531)和GenBank中的核酸數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)菌株SAU-2與腸球菌(Enterococcus sp.) SL02、SL03、SL04的相似性為98%，與芒地腸球菌(E.mundii) ATCC 43186、芒地腸球菌SS 1232、海氏腸球菌(E.hirae)NRIC 0109及屎腸球菌(E.faecium)SH 632的相似性為98%。因其16S rDNA序列與確定種名的菌株相似度最高僅為98%，故不能確定該菌的種名，僅能將菌株SAU-2鑒定為Enterococcus。菌株SAU-2在系統(tǒng)發(fā)育樹上與SL02等腸球菌處于發(fā)育樹的同一分支；與副腸系膜明串珠菌NCFB 2973(L.paramesenteroides)等近緣乳酸菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 菌株SAU-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SAU-2 based on 16S rDNA sequence

2.3 腸球菌SAU-2的毒力檢測(cè)

2.3.1 溶血性實(shí)驗(yàn)

將腸球菌SAU-2劃線于含體積分?jǐn)?shù)5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂上，于37℃培養(yǎng)24h后，未出現(xiàn)溶血圈，表明其不產(chǎn)溶血素。

2.3.2 PCR檢測(cè)腸球菌SAU-2的毒力因子

圖2 腸球菌SAU-2的毒力因子擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2 Eelectrophoresis of PCR amplification products of virulence factors

由圖2可知，腸球菌SAU-2未擴(kuò)增出agg、gelE、cylM、cylB、cylA、esp、efaAfm、cpd、cob、ccf、cyILL、cyILS、fsrB和hyLEfm等毒力因子的特異性片段。說明腸球菌SAU-2不存在以上毒力因子，腸球菌SAU-2是安全的。

2.4 SAU-2所產(chǎn)腸球菌素的生物學(xué)特性

2.4.1 細(xì)菌素的作用pH值范圍

圖3 SAU-2所產(chǎn)腸球菌素的活性pH值范圍Fig.3 Effect of pH on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2

由圖3可知，細(xì)菌素發(fā)酵上清液、鹽析液和粗提液顯示活性的pH值范圍很廣，發(fā)酵上清液顯示活性的pH值為2～9，鹽析液為2～10，粗提液為2～12。表明隨著純化的進(jìn)行，腸球菌素SAU-2的活性pH值范圍不斷擴(kuò)大。隨著pH值升高，發(fā)酵上清液、鹽析液和粗提液的抑菌活性都呈下降趨勢(shì)。當(dāng)pH值為2～5時(shí)，細(xì)菌素抑菌活性隨pH值升高快速下降；當(dāng)pH＞5時(shí)，細(xì)菌素抑菌活性緩慢下降。

2.4.2 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

圖4 腸球菌素SAU-2的熱處理結(jié)果Fig.4 Effect of heat on the antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2

由圖4可知，隨著處理溫度的升高，細(xì)菌素發(fā)酵上清液、鹽析液和粗提液活性喪失很少。經(jīng)121℃處理20min，細(xì)菌素發(fā)酵上清液、鹽析液和粗提液殘留的活性分別為原液(對(duì)照)的92%、97%和96%。表明腸球菌素SAU-2對(duì)熱很穩(wěn)定。

2.4.3 細(xì)菌素的酶敏感性

由圖5可知，模擬人體內(nèi)環(huán)境條件下，細(xì)菌素發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性完全喪失；經(jīng)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理后，活性基本無變化。粗提液經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理2、4、6h后，抑菌活性有所下降；經(jīng)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理2、4、6 h后，活性幾乎無損失。表明模擬人體內(nèi)環(huán)境條件下，細(xì)菌素發(fā)酵上清液和粗提液對(duì)胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的敏感性，對(duì)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

圖5 腸球菌素SAU-2的酶敏感性Fig.5 Antimicrobial activity of bacteriocin produced by SAU-2 after treatment with various proteases

在酶最適作用pH值和最適作用溫度下，細(xì)菌素粗提液經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌活性有部分降低；經(jīng)蛋白酶K處理后活性損失殆盡；經(jīng)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理后活性無變化。表明在酶處于最適作用pH值和最適作用溫度下，粗提液對(duì)蛋白酶K敏感性強(qiáng)，對(duì)胰蛋白酶有一定的敏感性，對(duì)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

2.4.4 細(xì)菌素的抑菌譜

表3 腸球菌素SAU-2的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of enterocin SAU-2

由表3可知，腸球菌素SAU-2對(duì)測(cè)試的9株G+細(xì)菌中的8株有抑菌活性，抑菌率為89%(8株/9株)。其對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌GIM1.228表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性(粗提液抑菌圈為35.02mm)；對(duì)2株芽孢桿菌有抑制作用；對(duì)銅綠假單胞桿菌ATCC 27853有抑菌活性；對(duì)測(cè)試的7株近緣乳酸菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性；粗提液對(duì)1株紅酵母也具有一定的抑菌活性。對(duì)測(cè)試的其他細(xì)菌和真菌無抑制作用(表3未列出，具體菌種見1.1節(jié))。以上表明該細(xì)菌素主要對(duì)近緣乳酸菌和G+細(xì)菌有抑菌作用，與大多數(shù)乳酸菌素的抑菌譜類似。粗提液對(duì)1株紅酵母產(chǎn)生抑制作用，而發(fā)酵上清液和鹽析液未表現(xiàn)出抑菌活性，表明隨著細(xì)菌素純度的提高，有可能會(huì)拓寬其抑菌譜。

3 討 論

3.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

迄今，除Nisin之外，已逾百種乳酸菌素被發(fā)現(xiàn)[2]。而多數(shù)乳酸菌素僅在酸性或中性pH值條件下才穩(wěn)定。因此，篩選寬譜pH細(xì)菌素具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值至6.0來篩選產(chǎn)寬譜pH細(xì)菌素的潛力菌株，優(yōu)于敖靈[4]、張艾青[17]等調(diào)pH4.5(僅排除有機(jī)酸干擾)及李悅[21]、吳榮榮[22]等調(diào)pH值至5.0篩選細(xì)菌素產(chǎn)生菌。

3.2 腸球菌的益處和潛在危害

腸球菌廣泛存在于自然界，其對(duì)地中海奶酪等發(fā)酵食品形成獨(dú)特風(fēng)味具有重要作用。腸球菌還被作為益生菌應(yīng)用于嬰兒配方食品、食品發(fā)酵劑和飼料添加劑。一些腸球菌還能產(chǎn)細(xì)菌素，從而抑制李斯特氏菌等致腐菌和致病菌，延長食品保質(zhì)期。但是某些腸球菌攜帶毒力因子。而且耐萬古霉素腸球菌(VRE)菌株數(shù)量不斷上升，隨著菌株的使用，可能會(huì)增加耐藥基因的傳播。因此，將腸球菌用于食品工業(yè)前，必須確保該菌株不含任何毒力因子和可傳遞的耐藥基因。本實(shí)驗(yàn)對(duì)腸球菌SAU-2進(jìn)行了毒力評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示腸球菌SAU-2為溶血素表型陰性和毒力因子基因型陰性，表明其是安全的，可作為食品發(fā)酵劑的后備菌種。

3.3 腸球菌素的特性

細(xì)菌素在適宜pH值環(huán)境下，才表現(xiàn)出抑菌活性；pH值過高或過低都會(huì)影響細(xì)菌素結(jié)構(gòu)，從而降低或喪失抑菌活性。目前，發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)腸球菌素具有較好的pH值穩(wěn)定性[9,23-25]。本研究的腸球菌素SAU-2活性pH值范圍很廣，能夠適應(yīng)不同食品的pH值要求。

乳酸菌素對(duì)熱的穩(wěn)定性因種類不同有一定差異。而發(fā)現(xiàn)的大部分腸球菌素都能耐受巴氏殺菌(65～80℃，15min)及以上溫度[9,23-27]。本研究的腸球菌素SAU-2經(jīng)121℃處理20min，抑菌活性幾乎無降低。表明該細(xì)菌素對(duì)熱很穩(wěn)定，能夠滿足食品加工過程對(duì)添加物質(zhì)耐熱的要求。

細(xì)菌素基本屬于蛋白質(zhì)或多肽范疇，往往能被蛋白酶類分解。其若能被酶類分解，就不會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)評(píng)價(jià)細(xì)菌素的安全性具有重要意義。少數(shù)細(xì)菌素還能被淀粉酶和脂肪酶分解失活[28-29]。本研究的腸球菌素SAU-2對(duì)蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，說明其作為食品防腐劑使用的安全性。而酶處于不同作用條件，對(duì)細(xì)菌素的降解能力有一定差異。本研究的細(xì)菌素粗提液在模擬人體內(nèi)環(huán)境條件下，只能被蛋白酶K部分降解；而在酶最適作用pH值和最適作用溫度下，能被蛋白酶K完全降解。

目前發(fā)現(xiàn)的腸球菌素主要抑制G+細(xì)菌，少數(shù)腸球菌素還能抑制大腸桿菌、沙門氏菌和假單胞等G-菌[9]。已發(fā)現(xiàn)的腸球菌素能抑制真菌和病毒很少。岳喜慶等[27]的屎腸球菌BC-3所產(chǎn)細(xì)菌素能抑制米曲霉，Wachsman等[30]的屎腸球菌素CRL35能抑制皰疹病毒。本研究的腸球菌素SAU-2主要對(duì)近緣乳酸菌和G+細(xì)菌有抑菌作用，與大多數(shù)乳酸菌素的抑菌譜類似。其對(duì)G-菌和真菌幾乎無抑菌性，可以通過添加其他抑菌物質(zhì)協(xié)同抑制得以改善。

本研究從川西高原奶渣中篩選到1株產(chǎn)寬譜pH細(xì)菌素的腸球菌SAU-2。腸球菌SAU-2溶血素表型陰性，agg等14個(gè)毒力因子基因型陰性，表明腸球菌SAU-2是安全的。腸球菌素SAU-2具有較寬的pH值作用范圍、良好的熱穩(wěn)定性和較廣譜的抑菌性，具有作為天然食品防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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Screening, Identification and Toxicity of a Strain of Wide pH Spectrum Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria and Characterization of Bacteriocin Produced by It

ZHOU Jia，LIU Shu-liang*，HU Xin-jie，ZHANG Yuan-e
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

SAU-2, a bacteriocin-producing strain, was screened out of 34 strains isolated from milk residue in West Sichuan plateau. The strain was identified as Enterococcus based on colonial morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence phylogenetic analysis. SAU-2 had no hemolytic activity. All the virulence factors of agg, gelE, cylM, cylB, cylA, esp, efaAfm, cpd, cob, ccf, cyILL, cyILS, fsrB and hyLEfm were negative. These results indicate that SAU-2 is safe. In addition, bacteriocin produced by SAU-2 could tolerate heat treatment at 121 ℃ for 20 min, and exhibited antibacterial activity at pH 2.0—12.0, but was sensitive to trypsin and proteinase K. It showed strong inhibitory effect on relative strains of SAU-2 and Gram-positive bacteria, and could also inhibit one strain of Pseudomonas aeruginosa and one strain of Rhodotorula glutinis, but had no inhibitory effect on other Gram-negative bacteria and fungi.

milk residue；Enterococcus；bacteriocin；virulence factors；characterization

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0194-06

2011-05-31

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(07ZA054)；四川省科技廳泡菜產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目(09ZC1270-4)

周佳(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：zj.onef@163.com

*通信作者：劉書亮(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：lsliang999@163.com