李婷婷，吳彩娥，方升佐，范龔建，吳海霞

青錢柳沖劑對糖尿病小鼠的降血糖功效

李婷婷，吳彩娥*，方升佐，范龔建，吳海霞

(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

研究青錢柳沖劑對鏈佐霉素所致糖尿病小鼠的降血糖功效。以鏈佐霉素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，設(shè)置模型對照組、正常對照組、陽性對照組以及青錢柳沖劑低、中、高劑量組，給藥21d后，測定小鼠的空腹血糖、體質(zhì)量、總膽固醇、甘油三酯、肝糖原等指標(biāo)，并對小鼠胰腺組織的病理切片進(jìn)行顯微鏡觀察病變情況。結(jié)果表明:與模型對照組相比，青錢柳沖劑各組均能顯著降低鏈佐霉素致糖尿病小鼠空腹血糖水平和總膽固醇量，顯著增加體質(zhì)量和肝糖原含量，并能減輕胰島細(xì)胞病變程度。提示青錢柳沖劑對糖尿病模型小鼠具有明顯治療作用，其作用機(jī)理與其能調(diào)節(jié)肝臟糖代謝、恢復(fù)病變胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。

青錢柳；沖劑；降血糖；糖尿病小鼠

青錢柳(Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja)系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬植物，是我國獨(dú)有的單種屬植物，因其樹形似柳，果實(shí)圓形似銅錢，色青而下垂，故名“青錢柳”[1]。眾多文獻(xiàn)報道表明青錢柳具有豐富的生物活性成分和較高的醫(yī)療價值[2-4]，據(jù)《中國中藥資源志要》記載[5]，其樹葉、樹皮、樹根可入藥，性溫，味辛微苦，具有清熱消腫、解毒、止痛功能；現(xiàn)代藥理學(xué)表明[6-9]，青錢柳提取物具有降血糖、降血壓、降血脂等生理活性，同時還有增強(qiáng)肌體免疫力、抗氧化、抗癌等生理功能，其在防治糖尿病方面功效尤為突出[10-12]。由此可見，青錢柳作為我國特有的保健食品資源，具有很高的應(yīng)用開發(fā)價值，然而到目前為止，由于我國對青錢柳的開發(fā)時間尚短，現(xiàn)報道的青錢柳開發(fā)利用多集中在對其活性物質(zhì)進(jìn)行提取、化學(xué)成分分析以及提取液的活性功能研究方面[13-17]，對青錢柳進(jìn)行深入的產(chǎn)品開發(fā)及其功效研究較少，因此如何高效利用這一極具保健功能和醫(yī)療價值的資源成為目前急需解決的問題。這對青錢柳的進(jìn)一步深入加工開發(fā)及產(chǎn)品的功效評判顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以青錢柳的活性成分為原料，對其進(jìn)行精深加工制備出顆粒沖劑，并研究其對糖尿病模型小鼠的降血糖功效作用，旨在為青錢柳的精深加工及進(jìn)一步開發(fā)青錢柳保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳，采自南京林業(yè)大學(xué)青錢柳苗圃基地，青錢柳沖劑由南京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制提供，其具體加工工藝與配方已申請專利[18]，專利申請?zhí)?01210007402.5。

SPF級ICR小鼠50只，體質(zhì)量18～22g，雌性，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證: SCXK(蘇)2008-0010，合格證編號:2012391。

鏈佐霉素 美國Sigma公司；檸檬酸 成都市科龍化工試劑廠；甲醛 南京寧誠化學(xué)藥品試劑有限公司；消渴丸(批號:2176) 廣州中一藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACCU-CHEK Advantage 血糖檢測系統(tǒng) 羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；AU2700全自動生化分析儀 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳沖劑的制備

青錢柳葉經(jīng)烘干粉碎，過篩，以一定料水比進(jìn)行超聲微波協(xié)同提取，提取上清液經(jīng)減壓濃縮，濃縮液加入4倍體積的無水乙醇反復(fù)沉淀，沉淀物配以不同種類適宜的輔料，經(jīng)制粒、干燥、整粒，得青錢柳沖劑[18]。

1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立

將鏈佐霉素用0.05mol/L檸檬酸配制成20mg/mL鏈佐霉素溶液。動物在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食24h，除正常組外，其余各小鼠均按200mg/kg的劑量尾靜脈注射鏈佐霉素，48h后檢測血糖濃度及體質(zhì)量。檢測血糖濃度在15～30mmol/L小鼠為造模成功。

1.3.3 動物分組及給藥

SPF級ICR小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型對照組、正常對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。高、中、低劑量組給藥量分別為2.0、1.0、0.5g/(kg·d)，用蒸餾水配成水溶液灌胃小鼠，每天1次，給藥21d；正常對照組和模型對照組小鼠灌胃給予等量溶媒(蒸餾水)，每天1次，持續(xù)21d；陽性對照組小鼠灌胃給予消渴丸2g/(kg·d)，每天1次，持續(xù)21d。實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料。

1.3.4 小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的測定

連續(xù)給藥3周，期間每周尾靜脈采血一次，測量血糖、體質(zhì)量，末次給藥后測得最終體質(zhì)量、血糖濃度。用血糖檢測儀測定小鼠血糖，電子天平測得小鼠體質(zhì)量。

1.3.5 小鼠總膽固醇、甘油三酯的測定

末次給藥后，空腹小鼠眼眶靜脈取血，全血離心得血清，用全自動生化分析儀測定總膽固醇、甘油三酯。

1.3.6 肝糖原含量的測定

取小鼠新鮮肝臟樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱質(zhì)量。按樣本質(zhì)量與堿液體積液料比1:3一起加入試管中，沸水浴煮20min，流水冷卻。將糖原水解液加蒸餾水稀釋成1%肝糖原檢測液，以蒽酮顯色法測定肝糖原含量[19]，測定波長為 620nm。

1.3.7 組織形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剖取小鼠胰腺組織，用10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋，制片(4μm厚)，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察胰腺病變，即內(nèi)分泌部胰島的狀況，包括在100倍低倍鏡下(目鏡10倍、物鏡10倍)測量每視野胰島數(shù)；用顯微測微器在100倍鏡下測量每個胰島的面積。計算出每個標(biāo)本平均胰島數(shù)，每個胰島的平均面積。

1.4 統(tǒng)計處理

數(shù)據(jù)用x－±s表示，組間分析用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，應(yīng)用SPSS 17.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳沖劑對小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的影響

表1 青錢柳沖劑對糖尿病小鼠體質(zhì)量與血糖值的影響Table 1 Effects of Cyclocarya paliurus granules on body weight and blood glucose of diabetic mice

由表1可知，模型對照組的血糖值極顯著高于正常對照組，表明小鼠高血糖模型成功。沖劑的高、中、低劑量組的小鼠血糖值均明顯低于模型對照組，其中，高劑量組與模型對照組相比較，其對血糖的降低作用達(dá)到了極顯著水平。從小鼠體質(zhì)量變化可以看出，模型對照組的小鼠體質(zhì)量極顯著低于正常對照組，在外形體征上模型對照組小鼠呈多飲、多尿、形體消瘦的典型糖尿病特征，而其他各組均呈現(xiàn)不同程度的改善，其中，與模型對照組相比，其他各組的小鼠體質(zhì)量均極顯著高于模型對照組。

2.2 青錢柳沖劑對小鼠總膽固醇和甘油三酯的影響

表2 青錢柳沖劑對糖尿病小鼠總膽固醇和甘油三酯的影響Table 2 Effects of Cyclocarya paliurus granules on serum total cholesterol and triglyceride levels of diabetic mice

糖尿病除了高血糖特征外，往往還伴隨著脂肪蛋白質(zhì)的代謝紊亂，因此，研究青錢柳沖劑對模型小鼠總膽固醇和甘油三酯的影響，以便全面考察該沖劑對糖尿病的治療效果。由表2可知，模型對照組的總膽固醇極顯著高于正常對照組，表現(xiàn)出糖尿病的并發(fā)癥狀，而陽性對照組和沖劑高、中劑量組總膽固醇量顯著低于模型對照組，可知青錢柳沖劑對于糖尿病所伴隨的總膽固醇的升高具有明顯的降低作用。而對甘油三酯的影響可以看出，本實(shí)驗(yàn)所建立的模型并未造成小鼠甘油三酯的異常，因此對小鼠進(jìn)行給藥后，也未對甘油三酯產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。

2.3 青錢柳沖劑對小鼠肝糖原含量的影響

糖原代謝是體內(nèi)糖代謝的重要組成部分，肝糖原是體內(nèi)血糖的重要來源。肝糖原合成減少，糖異生增多以及肝脂肪合成減少、分解增多是血糖增高的主要原因之一，在糖尿病機(jī)體中，肝臟伴有代謝變化，如肝細(xì)胞脂肪變性、肝糖原減少。由表3可知，模型對照組的小鼠糖原含量比正常對照組有極顯著降低，表明經(jīng)鏈佐霉素(STZ)誘導(dǎo)可以破壞肝糖原合成，使糖尿病小鼠的肝糖原處于較低水平。青錢柳沖劑低劑量組肝糖原含量與模型對照組比較，有顯著增加，而高劑量組和中劑量組的肝糖原有極顯著增加，表明青錢柳沖劑可以顯著提高肝糖原含量，促進(jìn)肝糖原恢復(fù)至正常水平，緩解糖尿病癥。

表3 青錢柳沖劑對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響Table 3 Effects of Cyclocarya paliurus granules on hepatic glycogen content of diabetic mice

2.4 青錢柳沖劑對模型小鼠胰腺組織的影響

表4 青錢柳沖劑對糖尿病小鼠胰腺組織的影響Table 4 Effects of Cyclocarya paliurus granules on pancreas in diabetic mice

由表4可知，模型對照組胰島細(xì)胞受到損失程度較大，胰島數(shù)目明顯減少，存留的胰島面積小，而陽性對照組和沖劑高、中劑量組的胰島數(shù)量及每個胰島面積比模型對照組明顯增多和增大。由此可見，青錢柳沖劑應(yīng)用后有減輕胰島病變的作用。

2.5 小鼠胰腺組織病理學(xué)觀察

圖1 小鼠胰腺組織病理切片F(xiàn)ig.1 Pathological changes of mouse pancreas

由圖1可知，與正常對照組胰腺組織切片相比，模型對照組胰島數(shù)目明顯減少，存留的胰島體積小，邊緣不整齊；胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目減少，排列松散，部分細(xì)胞體積增大，胞界欠清，呈輕度或中度變性。而在藥物應(yīng)用后有減輕胰島病變的作用，表現(xiàn)為顯著增加胰島數(shù)目，增大胰島面積，胰島細(xì)胞變性程度減輕，細(xì)胞排列較模型對照組致密程度增加。其中高劑量組效果較好，與模型對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，與正常組相似。

3 討 論

自青錢柳的降血糖生理活性被發(fā)現(xiàn)以后，眾多學(xué)者對其不同活性成分的藥效進(jìn)行了研究[20]，表明青錢柳的主要化學(xué)成分為黃酮類、三萜類、皂苷、甾醇、有機(jī)酸、生物堿和多糖等，其中多糖[21-22]、黃酮類[23]及微量元素[24]具有較好的降糖作用。有研究[25]表明青錢柳嫩葉中相關(guān)元素在人工胃液中有較好的溶出效果，提示青錢柳可以固體制劑形式為糖尿病人所吸收治療。本實(shí)驗(yàn)由此以降糖效果較好的多糖為主要原料，配以其他輔料開發(fā)成固體沖劑產(chǎn)品，通過STZ誘導(dǎo)所建立的小鼠糖尿病模型，評價了青錢柳沖劑的降糖作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:模型對照組小鼠血糖值顯著性高于正常對照組，給藥組不同程度降低了血糖值，其中沖劑高劑量組血糖值為(11.3±3.5)mmol/L，與模型對照組比較有極顯著性差異，由此可見該青錢柳沖劑對糖尿病血糖過高的典型特征具有明顯的治療作用。在糖尿病的眾多并發(fā)癥中血脂紊亂也是其中典型的癥狀之一，血脂檢測發(fā)現(xiàn)模型對照組總膽固醇升高、甘油三酯下降，而在給藥后各給藥組不同程度改善血脂指標(biāo)，其中沖劑高劑量組總膽固醇值分別為(2.286±0.412)mmol/L，與模型對照組比較有極顯著性差異，由此可見本沖劑不僅對血糖具有調(diào)節(jié)作用，還對膽固醇、血脂的異常有改善作用。

除血糖異常外，糖尿病小鼠還表現(xiàn)出體質(zhì)量極顯著減輕，肝糖原含量極顯著降低的特征，而經(jīng)給予不同劑量的青錢柳沖劑后，體質(zhì)量和肝糖原含量均有不同程度的增加，高劑量組達(dá)到極顯著水平。肝是糖代謝最主要的器官之一，肝糖原合成減少，糖異生增多以及肝脂肪合成減少、分解增多是血糖增高的主要原因之一[26]。肝糖原含量測定表明，高劑量組肝糖原含量與模型組相比極顯著增多，提示糖尿病小鼠給予青錢柳沖劑后，能調(diào)節(jié)肝臟糖代謝，增加肝糖原的合成，抑制肝糖異生，從而降低血糖濃度，這可能是青錢柳沖劑降血糖的機(jī)制之一。

此外，小鼠的胰腺組織病理學(xué)切片表明:糖尿病小鼠的胰島數(shù)量明顯減少，胰島面積小，邊緣不整齊。胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目減少，排列松散，部分細(xì)胞變性。藥物應(yīng)用后有減輕胰島病變的作用，增加胰島數(shù)目，增大胰島面積，減輕胰島細(xì)胞變性程度。由胰腺組織病理學(xué)切片圖的變化推斷其降血糖的作用機(jī)理為恢復(fù)病變胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)代謝，從而起到治療糖尿病的作用。

目前國內(nèi)外學(xué)者對青錢柳降血糖作用研究報道很多，但其作用機(jī)制的研究尚處于起步階段。在細(xì)胞層面，青錢柳的降糖機(jī)制表現(xiàn)為恢復(fù)受損的胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)糖尿病小鼠對葡萄糖的耐受力。張小芳[27]、易醒[12]等的研究均證實(shí)了這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過胰腺組織病理學(xué)切片也獲得相同的結(jié)果。此外，機(jī)體維持一定的血糖水平，是通過血中葡萄糖的利用與轉(zhuǎn)化、貯存之間的動態(tài)平衡來實(shí)現(xiàn)的，在控制血糖的生成與代謝上，除胰島素具有調(diào)節(jié)代謝以維持正常血糖外，肝臟糖原的分解與合成也是血糖含量的一個重要調(diào)節(jié)點(diǎn)，但此方面少有學(xué)者做過報道。本實(shí)驗(yàn)的肝糖原測定結(jié)果表明青錢柳能明顯的增加糖尿病小鼠肝糖原的合成，抑制肝糖異生，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的血糖濃度。在分子層面，青錢柳的降糖機(jī)制研究則更少，僅有報道青錢柳可以通過抑制α-葡萄糖苷酶[4,23]、糖原磷酸化酶[3]、酪氨酸磷酸酶(PTP1B)[8]的活性，來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)機(jī)體的血糖含量。但有關(guān)青錢柳如何參與機(jī)體的血糖代謝，以何種途徑影響相關(guān)酶的活性，以及其分子層面更深入的降血糖機(jī)理，尚有待進(jìn)一步研究。

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Antidiabetic Effect of Traditional Chinese Medicinal Cyclocarya paliurus Granules in Diabetic Mice

LI Ting-ting，WU Cai-e*，F(xiàn)ANG Sheng-zuo，F(xiàn)AN Gong-jian，WU Hai-xia
(Forest Resources and Environment Institute, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

The antidiabetic effect of Cyclocarya paliurus granules, a traditional Chinese medicine preparation based on Cyclocarya paliurus leaves, in streptozotocin (STZ) induced diabetic mice was evaluated in this study. Diabetes was induced in mice by using STZ. Model control, normal control, positive control and low, medium and high-dose Cyclocarya paliurus granule treatment groups were established. After 12 d of administration, the levels of fasting blood sugar, total cholesterol, triglyceride and hepatic glycogen and body weight in mice were measured. At the same time, histopathological examination of mouse pancreas was carried out to find pathological changes. The results showed that Cyclocarya paliurus granules significantly reduced blood glucose and total cholesterol levels in diabetic mice. In addition, Cyclocarya paliurus granules improved body weight and hepatic glycogen levels. Histopathological examination showed that Cyclocarya paliurus granules promoted the recovery of langerhans islet cells from pancreas necrosis associated with diabetes. All these data suggest that Cyclocarya paliurus granules have therapeutic effects on diabetic mice. The mechanism is probably related to their regulation of hepatic glucose metabolism and the function of langerhans islet cells.

Cyclocarya paliurus；granules；antidiabetic effect；diabetic mice

R965

A

1002-6630(2012)15-0287-04

2012-03-13

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)；國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(200904046)；

江蘇高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊科研計劃(蘇教科[2009]10號)；南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院青年基金項(xiàng)目[2009]

李婷婷(1982—)，女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称饭δ艹煞旨捌湫沦Y源開發(fā)利用。

E-mail:litingting82@163.com

*通信作者 吳彩娥(1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ艹煞旨捌湫沦Y源開發(fā)利用。E-mail:sxwucaie@163.com