劉軍偉，胡志和

超高壓處理對紫甘薯中多酚氧化酶活力的影響

劉軍偉，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

以濟(jì)薯18號為原料，研究超高壓結(jié)合溫度處理對紫薯多酚氧化酶(PPO)活力的影響。實驗壓力范圍100～600MPa，溫度20～60℃。結(jié)果表明:在溫度30℃、保壓時間10min的條件下，壓力在100～600MPa范圍內(nèi)，500MPa時紫薯多酚氧化酶的活力最高，并且高于自然酶活力；在600MPa壓力下，當(dāng)溫度小于30℃時，酶活力隨溫度上升而升高，大于30℃時，隨溫度升高酶活力下降。另外，酶活力隨保壓時間的延長而減小；但在300MPa時，前20min酶活力隨保壓時間延長而降低，20～50min內(nèi)隨時間延長而升高。因此，紫薯多酚氧化酶具有較好的耐壓性。對紫薯進(jìn)行溫度、壓力、保壓時間的L9(34)正交試驗結(jié)果表明:在600MPa、65℃條件下處理35min后，PPO活性最弱，抑制效果最佳。

超高壓；紫甘薯；多酚氧化酶

紫薯是我國近年引進(jìn)開發(fā)的一種用于工業(yè)加工的甘薯新品種，是一類具有紫色肉質(zhì)的高花青素甘薯品種，所含花青素具有抗氧化活性、降血壓和抗糖尿病等多種生理功能，以及膳食纖維等其他重要營養(yǎng)成分[1]，引起了許多學(xué)者的關(guān)注。紫薯花色苷的重要生理活性表現(xiàn)在抗氧化[2-5]、抗腫瘤[6-9]、抗高血糖[10-11]、抗高血壓[12]以及保肝作用[13-17]。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是植物體內(nèi)普遍存在的一種末端氧化還原酶[18]，是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，PPO催化果蔬原料中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化生成黑色素，嚴(yán)重影響制品的營養(yǎng)、風(fēng)味及外觀品質(zhì)。在紫薯深加工過程中，由于其組織中的多酚氧化酶與酚類物質(zhì)接觸，催化多酚類物質(zhì)氧化成鄰醌，再進(jìn)一步氧化聚合成黑色素[19]。因此，影響了精深加工和產(chǎn)業(yè)化，降低了產(chǎn)品的加工品質(zhì)。

超高壓加工技術(shù)(ultra-high pressure，UHP)屬于一種冷加工技術(shù)，在超高壓條件下，生物體高分子立體結(jié)構(gòu)中的氫鍵結(jié)合、疏水結(jié)合、離子結(jié)合等非共有結(jié)合發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)變性、淀粉糊化、酶失活、細(xì)胞膜破裂、菌體內(nèi)成分泄漏，使微生物因菌體破壞而死亡。蛋白質(zhì)的氨基酸的縮氨結(jié)合、維生素、香氣成分等低分子化合物是共有結(jié)合，在超高壓下不會破壞而得以完整地保留。目前，國內(nèi)的食品超高壓處理技術(shù)還處于研究階段，但超高壓食品符合新型食品的簡便、安全、天然、營養(yǎng)的消費需求，具有潛在的市場發(fā)展前景。

為了在生產(chǎn)紫薯色素、分離淀粉過程中防止紫薯中多酚類物質(zhì)的褐變，本實驗對紫薯PPO的酶學(xué)性質(zhì)以及褐變抑制進(jìn)行初步的研究，為紫薯加工過程中抑制褐變的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯為山東濟(jì)薯18號。

鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；Sigma 3-18K離心機(jī) 美國Sigma公司；UVWIN5紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

新鮮紫薯→清洗→稱質(zhì)量→包裝→超高壓處理

1.3.2 紫薯PPO酶液的提取和活力測定

1.3.2.1 紫薯PPO酶液的提取

參照袁根良等[20]方法，有所改進(jìn)。稱取超高壓處理后的紫薯小塊50g，加入200mL預(yù)冷的(4℃)磷酸緩沖液(1.76g Na2HPO4·12H2O和5.5g NaH2PO4·2H2O加水溶解，定容至200mL，pH6.0)于高速組織搗碎機(jī)中打漿，漿液在4℃、8000r/min離心15min，取上清液。

1.3.2.2 紫薯PPO反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜分析

依次向試管中加入pH6.0的磷酸緩沖液10mL、0.2mol/L的鄰苯二酚1.0mL，再加入酶液0.5mL迅速搖勻，30℃反應(yīng)10min后，反應(yīng)產(chǎn)物在200～500nm范圍內(nèi)每隔10nm進(jìn)行掃描。

1.3.2.3 紫薯PPO酶促反應(yīng)最佳反應(yīng)時間確定

紫薯PPO與底物反應(yīng)后，在不同時間段檢測波長300nm的吸光度變化。

1.3.2.4 紫薯PPO殘余酶活力的測定

PPO活性測定采用消光值法，并有所改進(jìn):依次向試管中加入pH6.0的磷酸緩沖液10mL、0.2mol/L的鄰苯二酚1.0mL，再加入0.5mL酶液迅速搖勻，30℃反應(yīng)10min后立即在300nm波長處測定其吸光度(A300nm)，以每分鐘吸光度增加0.001為一個酶活力單位。以未經(jīng)超高壓處理的紫薯為空白對照。PPO的殘余酶活力按照下式計算:

1.3.3 試驗設(shè)計

1.3.3.1 單因素試驗

將紫薯塊切成3mm×3mm×3mm后，以磷酸鹽緩沖液(pH6.0)為介質(zhì)裝袋，后經(jīng)超高壓處理，分別考察壓力、溫度、保壓時間對PPO活性的影響。

壓力的影響:在30℃處理紫薯10min，考察不同壓力(100、200、300、400、500、600MPa)對PPO活力的影響。溫度的影響:在600MPa處理紫薯10min，考察不同溫度(20、30、40、50、60℃)對PPO活力的影響。保壓時間的影響:在30℃的條件下分別在300、500、600MPa壓力下處理10、20、30、40、50min，考察其對PPO活力的影響。

1.3.3.2 正交試驗

將紫薯塊裝袋密封，選用超高壓壓力、處理溫度和保壓時間作為試驗因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗，篩選抑制紫薯中PPO活性的壓力、溫度和保壓時間的最佳組合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每測定重復(fù)兩次，分別平行取樣，結(jié)果以平均值計算。全部實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯PPO反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜分析

圖1 紫薯PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of products of the enzymatic reaction catalyzed by PPO from purple sweet potato

紫薯PPO與鄰苯二酚的反應(yīng)產(chǎn)物醌于200～500nm波長下每隔20nm掃描光密度，形成吸收光譜圖(圖1)。圖1顯示，醌在300nm波長處有最大吸收峰。因此，后續(xù)實驗均在300nm波長處測定吸光度。

2.2 紫薯PPO酶促反應(yīng)最佳反應(yīng)時間確定

圖2 紫薯PPO酶促反應(yīng)隨時間的變化Fig.2 Selection of optimal enzymatic reaction time for PPO activity determination

取制備的PPO粗酶液反應(yīng)體系，每隔1min檢測波長300nm的吸光度變化，直至前后連續(xù)3次檢測的示值差小于1%時，則認(rèn)定其酶促反應(yīng)趨于穩(wěn)定。由圖2可知，PPO酶促反應(yīng)速度在0～3min內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，其后反應(yīng)速度變慢，10min后反應(yīng)趨于穩(wěn)定，所以均以反應(yīng)時間10min時的吸光度來表示PPO的酶活力。

2.3 單因素試驗

2.3.1 壓力對PPO活性的影響

圖3 壓力對紫薯PPO殘余酶活力的影響Fig.3 Effect of pressure on residual PPO activity in purple sweet potato after combined UHP and heat treatment

由圖3可知，100～400MPa處理后，PPO殘余酶活力均有所下降，但隨著壓力的升高殘余酶活力逐漸升高；并且在500MPa處理下，與未處理的對照樣酶活力相比PPO殘余酶活為1.066；600MPa時殘余酶活為0.875?？傮w來說，壓力可以在一定程度上降低酶的活性。但材料不同，結(jié)果有一定的差異性。曾慶梅等[21]研究了超高壓處理對對碭山梨汁中多酚氧化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)200～300MPa處理梨汁時多酚氧化酶被激活，活性表現(xiàn)最高，超過300MPa后活性逐漸降低。但在本實驗條件下，600MPa處理下還不足以使紫薯中的PPO完全失活，這表明紫薯中的PPO是一種強耐壓性的酶。

2.3.2 溫度對PPO活性的影響

圖4 溫度對紫薯PPO殘余酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on residual PPO activity in purple sweet potato after combined UHP and heat treatment

由圖4可知，在600MPa壓力條件下處理10min，紫薯PPO殘余酶活力隨著處理溫度的升高先升高后降低，在30℃時達(dá)到最大，之后迅速下降；60℃時降到0.278。因此用溫度與壓力協(xié)同作用對PPO滅活時，需要選用40℃以上的溫度才可以有顯著的協(xié)同效果。這一結(jié)果與韓永斌等[22]研究超高壓對山藥泥中多酚氧化酶活力的影響，得到相似結(jié)果。

2.3.3 保壓時間對PPO活性的影響

圖5 保壓時間對紫薯PPO殘余酶活力的影響Fig.5 Effect of pressure holding time on residual PPO activity in purple sweet potato after combined UHP and heat treatment

隨保壓時間的延長，大多數(shù)酶的活力逐漸下降，但超過一定時間后影響不顯著[23]。由圖5可知，在壓力600MPa處理下，保壓時間越長殘余酶活力越低，表明較高壓力處理后，可以使酶產(chǎn)生不可逆的失活；500MPa時，隨保壓時間先升高后降低，20min時最高，可能是處于附著狀態(tài)的酶被完全釋放出來，但壓力不足以將其滅活，綜合提高了酶的活性；300MPa處理后，殘余酶活隨時間延長先降低后升高，因為低壓下酶的失活通常是可逆的。因此要在短時間內(nèi)盡可能的降低酶活力，必須采用高壓處理。

2.4 正交試驗

表1 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 1 L9(34) orthogonal array design and corresponding experimental results

由表1可知，第7組組合A3B3C1處理對PPO抑制效果最好。因此，表觀確定超高壓最佳處理條件為600MPa、65℃、25min。由極差分析結(jié)果可知:極差越大抑制酶活力越好，對抑制酶活力的影響因子的作用大小順序為A＞B＞C。由正交表極差分析得出最佳組合為A3B3C2，即壓力600MPa、溫度65℃、保壓時間35min，但加熱會使原料的質(zhì)地、顏色和風(fēng)味改變以及熱敏性物質(zhì)遭破壞。因此一定的溫度配合一定的高壓來處理原料可使各方面都有所兼顧，當(dāng)溫度升至55℃時，隨著壓力的增大PPO活性明顯減小，綜合比較，A3B2C2(600MPa、55℃、35min)也許在實驗效果理論上優(yōu)于A3B3C2，待進(jìn)一步實驗證明。

3 結(jié) 論

3.1 紫薯PPO酶促反應(yīng)的最大吸收波長在300nm處，酶促反應(yīng)最佳時間為10min。

3.2 在30℃、10min條件下，100～400MPa處理后，PPO殘余酶活力均有所下降，但隨著壓力的升高殘余酶活力逐漸升高；500MPa時PPO被激活，活性達(dá)到最大；600MPa處理后殘余酶活力為0.875，效果不顯著。

3.3600 MPa處理10min，隨著溫度的升高，紫薯PPO活性先升高后降低，在30℃時達(dá)到最高。因此，用溫度與壓力協(xié)同作用進(jìn)行PPO滅活時，需要選用40℃以上的溫度才可以有顯著的協(xié)同效果。

3.4 在壓力600MPa處理下，保壓時間越長殘余酶活力越低；500MPa時，隨保壓時間先升高后降低，20min時最高；300MPa處理后，殘余酶活力隨時間延長先降低后升高。

3.5 利用正交試驗優(yōu)化超高壓處理對紫薯PPO酶活力殘存率得到工藝條件為壓力600MPa、溫度65℃和保壓時間35min。

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Effect of Ultra High Pressure Treatment on Polyphenol Oxidase Activity in Purple Sweet Potato

LIU Jun-wei，HU Zhi-he*
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Purple sweet potato Jishu 18 was used to investigate the effect of combined ultra high pressure (UHP, 100—600 MPa) and heat (20—60 ℃) treatment on polyphenol oxidase (PPO) activity in purple sweet potato. The results showed that in the investigated range of pressure, UHP treatment at 500 MPa and 30 ℃ for 10 min resulted in maximum PPO activity in Jishu 18, exceeding the pre-treatment activity level. When the UHP pressure was 600 MPa, PPO activity in Jishu 18 indicated an upward trend with increasing temperature up to 30 ℃, followed by a decline at higher temperature. Moreover, a decreasing trend was found with prolonged pressure holding time. PPO activity decreased gradually during the first 20 min of UHP treatment at 300 MPa, but increased during the subsequent 30 min. Consequently, PPO activity is tolerant to high pressure. The results of orthogonal array design experiments revealed that treatment at 600 MPa and 65 ℃ for 35 min had the best inhibitory effect on PPO activity in purple sweet potato.

ultra-high pressure；purple sweet potato；polyphenol oxidase

TS205.9

A

1002-6630(2012)15-0262-04

2011-10-23

劉軍偉(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail:liujunweidalao@126.com

*通信作者:胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail:hzhihe@tjcu.edu.cn