薛海燕，李 韻，張小苗，符海英，鄒聯(lián)柱，宋宏新*

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

3種特異性IgY與IgG相對(duì)親和力特性的比較研究

薛海燕，李 韻，張小苗，符海英，鄒聯(lián)柱，宋宏新*

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

采用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法兩種方法，分別對(duì)牛β-酪蛋白、κ-酪蛋白和大腸桿菌O157:H7與對(duì)應(yīng)抗原的卵黃抗體(IgY)與免疫球蛋白(IgG)抗體相對(duì)親和力特性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明：3種特異性IgY與抗原的相對(duì)親和力比IgG要高，對(duì)蛋白抗原，兩種抗體的相對(duì)親和力相差不大，而對(duì)大腸桿菌O157:H7，兩種抗體的差別明顯加大，IgY的相對(duì)親和力較IgG強(qiáng)。兩類乳源蛋白抗體親和力比較，發(fā)現(xiàn)κ-酪蛋白抗體與抗原的親和力高于β-酪蛋白抗體，前者用于乳品免疫檢測(cè)中，可提高方法靈敏度。

酪蛋白；大腸桿菌O157:H7；相對(duì)親和力；卵黃抗體；IgG

卵黃免疫球蛋白(immnunoglobins of yolk，IgY)又稱卵黃抗體，與血清免疫球蛋白G (immnunoglobin G，IgG)是分別來源于卵黃和血清的兩種多克隆抗體，二者在結(jié)構(gòu)上有所不同，但均具有與抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)[1]，因此可普遍應(yīng)用于免疫檢測(cè)當(dāng)中。目前，這兩類抗體在微生物及其毒素、農(nóng)藥和抗生素殘留等的檢測(cè)方面應(yīng)用研究較多[2-6]。此外，利用這兩類抗體，通過免疫檢測(cè)技術(shù)對(duì)乳品質(zhì)量進(jìn)行分析的研究[7-9]。其中，基于乳源蛋白含量和比例的摻假檢測(cè)方法憑借其能檢測(cè)任何物質(zhì)摻假方式的優(yōu)勢(shì)具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。在食品質(zhì)量安全監(jiān)控中，大多數(shù)物質(zhì)可看作抗原，制備相應(yīng)抗體后，利用抗原抗體的免疫反應(yīng)進(jìn)行質(zhì)與量的檢測(cè)，則抗體的優(yōu)劣對(duì)于免疫檢測(cè)的結(jié)果將起到非常關(guān)鍵的作用[11-12]?？贵w的親和力特性反映的是抗體與抗原結(jié)合的牢固程度，是衡量抗體性能的一個(gè)重要指標(biāo)，也是捕獲或檢測(cè)用抗體選擇時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素?？贵w親和力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有很多，廣泛應(yīng)用的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，該法簡(jiǎn)單、快速，而且使用的抗體和抗原的量較少，還可無需純化抗體和抗原[13]。本研究利用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法對(duì)抗牛β-酪蛋白(βcasein，β-CN)、κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)、大腸桿菌O157:H7 (Escherichia coli O157:H7)的IgY與IgG三組抗體與相應(yīng)抗原的親和力進(jìn)行對(duì)比考察，為該食源性疾病病原菌及乳品質(zhì)量分析抗體選擇提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HRP標(biāo)記羊抗兔IgG與HRP標(biāo)記兔抗雞IgG 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；牛β-酪蛋白與κ-酪蛋白美國Sigma公司；大腸桿菌O157:H7 本實(shí)驗(yàn)保藏；四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 美國Amresco公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Electron公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；多道移液器芬蘭雷勃公司；微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；PB-10型酸度計(jì) 德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 IgY與IgG的制備

分別以β-CN、κ-CN、E.coli O157:H7為抗原，免疫健康臨產(chǎn)蛋母雞與雄性新西蘭兔制備IgY與IgG抗體，每一種抗原免疫3只動(dòng)物，設(shè)1只動(dòng)物用生理鹽水替代抗原免疫作為陰性對(duì)照。IgY抗體的制備及分離純化參見文獻(xiàn)[14]，IgG抗體的制備及分離純化參見文獻(xiàn)[15]。純化后經(jīng)間接ELISA及電泳檢測(cè)，3種IgY抗體的效價(jià)分別為1:2000、1:2000、1:4000，純度達(dá)到90%以上；3種IgG抗體的效價(jià)分別為1:4000、1:4000、1:8000，純度達(dá)到95%以上。

1.2.2 親和力測(cè)定時(shí)最佳抗原包被濃度的確定

采用ELISA的基本方法對(duì)IgY及IgG兩種抗體的相對(duì)親和力進(jìn)行衡量，因此首先確定兩種抗體在進(jìn)行ELISA效價(jià)測(cè)定時(shí)的最佳抗原包被濃度。結(jié)果顯示，牛β-CN、κ-CN和E.coli O157:H7這3種抗原在測(cè)定IgY時(shí)最佳包被濃度分別為25μg/mL、25μg/mL和109CFU/mL，測(cè)定IgG時(shí)分別為6.25μg/mL、1.5625μg/mL和108～109CFU/mL。

1.2.3 硫氰酸銨洗脫法測(cè)定兩種抗體的相對(duì)親和力

參照文獻(xiàn)[16]，結(jié)合所測(cè)抗體的特性，稍作改進(jìn)，分別測(cè)定兩種β-CN、κ-CN、E.coli O157:H7的抗體(IgY及IgG)的相對(duì)親和力。生理鹽水免疫所獲雞蛋提取IgY或兔血清為陰性對(duì)照，每種抗原設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果OD450nm值為3組平均值。ELISA檢測(cè)方法如下：

根據(jù)公式(1)計(jì)算抗體保留率，并繪制硫氰酸銨濃度與抗體保留率的關(guān)系曲線。

式中：(OD450nm)i、 (OD450nm)m分別為添加和未添加硫氰酸銨洗脫時(shí)的OD450nm值。

1.2.4 尿素洗脫法測(cè)定兩種抗體的相對(duì)親和力指數(shù)

尿素洗脫法曾是醫(yī)學(xué)上用于測(cè)定血液中抗病毒IgG親和力的方法[17]，本實(shí)驗(yàn)借鑒此方法，參考Condorelli等[18]的研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，該方法與硫氰酸銨洗脫法類似，只是以300μL 8mol/L尿素替代硫氰酸銨，常溫靜置3min對(duì)抗體進(jìn)行解離，重復(fù)尿素洗滌過程兩次，其余同硫酸氰胺法。設(shè)置對(duì)照孔以ELISA洗滌液PBST進(jìn)行洗滌，利用公式(2)計(jì)算抗體的相對(duì)親和力指數(shù)。

式中：(OD450nm)urea為尿素洗脫孔的OD450nm值；(OD450nm)PBST為PBS-吐溫洗脫孔的OD450nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫氰酸銨洗脫法測(cè)定相對(duì)親和力結(jié)果

2.1.1 兩種β-CN抗體親和力的比較

對(duì)兩種β-CN抗體，經(jīng)不同濃度硫氰酸銨洗脫后，得到硫氰酸銨濃度與抗體保留率的關(guān)系曲線，如圖1所示。隨硫氰酸銨濃度增大，兩種抗體的保留率均有一個(gè)較迅速的下降過程，在硫氰酸銨濃度小于3mol/L 時(shí)，IgY的曲線整體位于IgG的之上，這表明此時(shí)用相同濃度的硫氰酸銨處理β-CN抗原抗體復(fù)合物時(shí)，IgY抗體的保留率更大，它與β-CN抗原結(jié)合的更牢固，其親和力相對(duì)IgG抗體更高；用量在3～5mol/L之間，兩者保留率相差不大且處于平臺(tái)期，可能為兩種抗原抗體復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上具有一定的協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)濃度達(dá)到6mol/L時(shí)，IgG的保留率幾乎為0，即幾乎全部的復(fù)合物被解離，而與IgY抗體形成的復(fù)合物具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖1 抗β-CN抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.1 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of antiβ-CN antibody

2.1.2 兩種κ-CN抗體親和力比較

圖2 抗κ-CN抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.2 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of antiκ-CN antibody

對(duì)兩種κ-CN抗體經(jīng)硫氰酸銨洗脫后，測(cè)得抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系如圖2所示。IgY的曲線同樣在IgG曲線之上，因此，可知IgY抗體與其相應(yīng)抗原κ-CN的結(jié)合程度比IgG抗體更為緊密，不易被硫氰酸銨洗脫，IgY對(duì)相應(yīng)抗原的親和力比IgG強(qiáng)。同時(shí)，經(jīng)圖1與圖2曲線的比較可知，當(dāng)無論是IgY抗體或IgG抗體，抗κ-CN抗體保留率降至50%時(shí)，硫氰酸銨的濃度約在4.5mol/L以上，而抗β-CN抗體降至相同程度時(shí)，硫氰酸銨濃度約小于2mol/L，這說明抗β-CN抗體對(duì)硫氰酸銨的洗脫作用更為敏感，其與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合能力相對(duì)較弱。即制備所得抗κ-CN抗體親和力大于抗β-CN抗體。當(dāng)以牛乳酪蛋白檢測(cè)對(duì)象時(shí)，選擇κ-CN及其抗體為捕獲抗體，不易受到乳中其他物質(zhì)的干擾，可提高檢測(cè)靈敏度。

2.1.3 抗大腸桿菌O157:H7抗體親和力比較

圖3 抗大腸桿菌O157:H7抗體保留率與硫氰酸銨濃度關(guān)系曲線Fig.3 Relationship between ammonium thiocyanate concentration and the retention rate of anti-E. coli O157:H7 antibody

硫氰酸銨濃度與抗大腸桿菌O157:H7抗體保留率的關(guān)系曲線如圖3所示。在洗脫用硫氰酸銨濃度一致條件下，IgY的保留率基本都比IgG大，隨硫氰酸銨的濃度的增加，IgY與IgG的相對(duì)親和力差異增加，IgY與E.coli O157:H7形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。當(dāng)IgY抗體保留率降至50%時(shí)，硫氰酸銨的濃度為4mol/L，而對(duì)IgG只需用2mol/L硫氰酸銨洗脫就能達(dá)到同樣的效果。這表明IgY抗體與E.coli O157:H7抗原的結(jié)合能力較IgG強(qiáng)，IgY在親和力特性方面較IgG具有優(yōu)勢(shì)。與蛋白抗原相比，菌體抗原對(duì)應(yīng)的兩種抗體與抗原的結(jié)合力能力相差更大。IgY更適于菌體抗原的捕獲檢測(cè)。

2.2 尿素洗脫法測(cè)定3組特異性抗體的相對(duì)親和力指數(shù)結(jié)果

由表1可知，抗β-CN、κ-CN和E.coli O157:H7 IgY的相對(duì)親和力指數(shù)都在79%以上，而相應(yīng)的3種IgG的相對(duì)親和力指數(shù)在60%以下，因此，3種特異性IgY與其相應(yīng)抗原的結(jié)合更為牢固，受尿素洗脫的影響較小，其與對(duì)應(yīng)抗原親和力比IgG強(qiáng)，這與硫氰酸銨洗脫法測(cè)定得到的結(jié)論是一致的。

3 結(jié) 論

利用硫氰酸銨和尿素洗脫ELISA法對(duì)抗β-CN、κ-CN和大腸桿菌O157:H7的IgY和IgG抗體的相對(duì)親和力進(jìn)行了比較研究，3種抗原對(duì)應(yīng)的特異性IgY在相對(duì)親和力特性方面均優(yōu)于IgG抗體，在多克隆抗體的應(yīng)用研究中，可采用IgY進(jìn)行替代IgG，同時(shí)還具有抗體產(chǎn)生量大、易收集、利于動(dòng)物福利等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于兩種抗乳源蛋白抗體，κ-CN抗體的相對(duì)親和力較強(qiáng)，采用免疫吸收等方法減小交叉反應(yīng)性后，較適用于乳樣品的特異性或牛羊乳摻假區(qū)別檢測(cè)。相對(duì)而言，硫氰酸銨洗脫ELISA法能夠得到一個(gè)相對(duì)親和力的參考區(qū)間范圍，能夠更好的考察抗原抗體復(fù)合的整體結(jié)合能力及變化趨勢(shì)。抗體的親和力是決定抗體優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，簡(jiǎn)單易行的相對(duì)親和力檢測(cè)方法為抗體的深入應(yīng)用研究建立良好開端，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)為免疫檢測(cè)中抗體的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

[1]張小鶯, 趙津子, 陳琛, 等. 半抗原免疫分析在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 397-401.

[2]葛萃萃, 鐘青萍, 張旺, 等. 雙抗夾心ELISA 檢測(cè)食品中大腸桿菌O157:H7方法研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 171-175.

[3]VALERA E, AZCON J R, SANCHEZ F J, et al. Conductimetric immunosensor for atrazine detection based on antibodies labelled with gold nanoparticles[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2008, 134: 95-103.

[4]胡擁明, 梁沙莉, 徐麗廣, 等. 氯霉素免疫檢測(cè)方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(20): 416-419.

[5]XU Zhenlin, XIE Guimian, LI Yongxiang, et al. Production and characterization of a broad-specificity polyclonal antibody for O, O-diethyl organophosphorus pesticides and a quantitative structure-activity relationship study of antibody recognition[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 647(1): 90-96.

[6]DUAN Zhaohui, LIN Zhuangsen, YAO Herui, et al. Preparation of artificial antigen and egg yolk-derived immunoglobulin (IgY) of citrinin for enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Biomedical And Environment Sciences, 2009, 22(3): 237-243.

[7]HURLEY I P, COLEMAN R C, IRELAND H E, et al. Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(7): 805-812.

[8]邢淑婕, 劉開華. 牛奶中三聚氰胺的ELISA檢測(cè)研究[J]. 中國食品添加劑, 2009(5): 187-191.

[9]SONG Hongxin, XUE Haiyan, HAN Yan. Detection of cow,s milk in Shaanxi goat,s milk with an ELISA assay[J]. Food Control, 2011, 22 (6): 883-887.

[10]宋宏新, 柏紅梅, 薛海燕, 等. 基于乳源蛋白質(zhì)分析的乳品質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)探討[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(9): 298-301.

[11]邵輝, 吳瑕, 王劍飛, 等. 酶聯(lián)免疫法與乳及乳制品中抗生素殘留的檢測(cè)[J]. 中國乳品工業(yè), 2011, 39(6): 58-59; 64.

[12]CHEN C C, TAI Y C, SHEN S C, et al. Detection of alkaline phosphatase by competitive indirect ELISA using immunoglo- bulin in yolk (IgY) specific against bovine milk alkaline phosphatase[J]. Food Chemistry, 2006, 95(2): 213-220.

[13]王惠欣. 應(yīng)用ELISA方法計(jì)算抗體親和力的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江醫(yī)藥, 2011, 24(2): 241-242.

[14]宋宏新, 柏紅梅, 薛海燕, 等. 酪蛋白和乳球蛋白的抗體及酶標(biāo)物制備研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 486-489.

[15]王廷華, 李官成. 抗體理論與技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2005: 256-260.

[16]WANG Gang, WANG Yan, LI Chunying, et al. Thiocyanate elution measurement of relative affinity of phage antibodies[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2004, 20(3): 429-433.

[17]程道勝, 梁惠強(qiáng), 李時(shí)英. 風(fēng)疹病毒特異性IgG抗體親和力測(cè)定的臨床意義[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 22(1): 97-98.

[18]CONDORELLI F, STIVALA A, GALLO R, et al. Improvement in establishing thepeptoid of rubella primary virus infection using a mild protein denaturant[J]. Journal of Virol Methods, 1997, 66(1): 109-112.

Comparative Study on Relative Affinity of Three Types of Specific IgY and IgG

XUE Hai-yan，LI Yun，ZHANG Xiao-miao，F(xiàn)U Hai-ying，ZOU Lian-zhu，SONG Hong-xin*
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

The relative affinity of anti-bovine β-casein, κ-casein, E. coli O157:H7 IgY and IgG with their corresponding antigens was investigated using ammonium sulfocyanate and urea elution ELISA methods. The results indicated that three kinds of IgY had higher relative affinity with their corresponding antigens when compared to IgG. A significant difference between IgY and IgG against E. coli O157:H7 was observed, whereas slight differences were found for β-casein and κ-casein. Besides, the affinity of κ-casein with its corresponding antibodies showed an increase when compared to β-casein. Therefore, anti-κ-casein antibody is more suitable for the detection of milk samples than anti-β-casein antibody.

casein；Escherichia coli O157:H7；relative affinity；IgY；IgG

TS207.3

A

1002-6630(2012)11-0163-04

2011-08-04

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012JM2009)；陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)(2010JK425)；陜西科技大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZX10-22)

薛海燕(1979—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称访庖邫z測(cè)技術(shù)。E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn

*通信作者：宋宏新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：songhx@sust.edu.cn