趙玉紅，金秀明

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

梅花鹿鹿茸膠原的理化特性研究

趙玉紅，金秀明

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

對(duì)胃蛋白酶法在酸性條件下制備的梅花鹿鹿茸膠原的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。通過(guò)紫外掃描(UV)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、氨基酸組成測(cè)定、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和示差量熱掃描(DSC)等方法對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析。紫外掃描圖譜可知，膠原純度較高，在230nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰；紅外光譜表明其酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ譜帶等主要吸收峰與Ⅰ型膠原標(biāo)品一致，具有三螺旋結(jié)構(gòu)；凝膠電泳表明鹿茸膠原含有α1、α2和β鏈，符合Ⅰ型膠原特征；氨基酸分析說(shuō)明其具有典型膠原的氨基酸組成；示差量熱掃描測(cè)得其熱收縮溫度(ts)為84.05℃。梅花鹿鹿茸具有典型的I型膠原的理化特性。

梅花鹿鹿茸；膠原；大分子蛋白；結(jié)構(gòu)特性；理化性質(zhì)

膠原是一類富有多樣性和組織分布特異性的蛋白質(zhì)的總稱[1]，是一種纖維狀、大分子結(jié)構(gòu)蛋白，由3條肽鏈組成螺旋形纖維狀，主要分布于動(dòng)物的皮膚、骨骼、肌腱、角膜等一些器官中。不同種族、不同組織中的膠原有著不同的化學(xué)組成和構(gòu)成，目前，人們已發(fā)現(xiàn)26種不同類型的膠原，各類型間結(jié)構(gòu)差異主要在于多肽鏈的初級(jí)結(jié)構(gòu)不同。膠原具有重要的生理功能，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體，維持機(jī)體完整性的作用[2]，并與哺乳動(dòng)物肌肉韌性有關(guān)[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原的利用主要分為兩類：一方面，膠原具有獨(dú)特的纖維性能，可用于相紙底片、紡織、造紙等[4]；另一方面，由于膠原具有良好的生物相容性、生物降解性，低的免疫原性、保濕活性以及大規(guī)模生產(chǎn)的可行性優(yōu)點(diǎn)，正在成為醫(yī)藥、化妝品和食品業(yè)的新寵[5]。由于膠原具有廣闊的市場(chǎng)前景，近年來(lái)對(duì)膠原性質(zhì)的研究也日趨增多，其中主要是對(duì)海產(chǎn)品中膠原特性的研究[6-8]，而對(duì)鹿茸中膠原的研究較少。鹿茸是梅花鹿或馬鹿尚未骨化的幼角，含有膠原、多糖、磷脂等多種生物活性物質(zhì)，具有廣泛的生理功能和藥理作用。對(duì)鹿茸膠原理化性質(zhì)的研究局限于李銀清[9]采用醇法提取鹿茸膠原，并研究其部分理化性質(zhì)，但未對(duì)其結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)以梅花鹿鹿茸為原料，研究胃蛋白酶法提取的膠原的紫外光譜、紅外光譜、氨基酸組成、分子質(zhì)量和熱收縮溫度等結(jié)構(gòu)特性，以期為深入研究和利用鹿茸膠原提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

梅花鹿鹿茸 黑龍江大莊園集團(tuán)。

胃蛋白酶、MD-44透析袋要、標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白美國(guó)Sigma公司；冰乙酸、NaCl均為分析純。

PowerPac Basic電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TGL-20M低溫離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；ALPHA1-2真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；IR 560 E.S.P傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Pyris 6熱流型示差掃描量熱儀 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 梅花鹿鹿茸膠原的提取純化

將鮮鹿茸去皮，脫血后，切成2～3mm見(jiàn)方的小塊，乙醚浸泡處理2h進(jìn)行初步脫脂。脫脂后冷凍干燥24h，粉碎，過(guò)40目篩。取一定量鹿茸粉末，用10倍體積的0.1mol/L NaOH溶液 4℃浸泡24h，蒸餾水洗至中性。固形物溶于0.5mol/L的醋酸和一定量胃蛋白酶中，4℃條件下提取72h，7600×g低溫離心20min，上清液于4℃保存?zhèn)溆?。所得沉淀重?fù)提取兩次。合并上清液，即為鹿茸膠原粗提液。向膠原粗提液中加入固體氯化鈉至其濃度為2mol/L，鹽析過(guò)夜，10000r/min低溫離心30min，棄去上清液，將析出的膠原液移入透析袋中，透析4 8 h。冷凍干燥，得梅花鹿鹿茸膠原。

1.2.2 紫外光譜分析

取一定量的膠原用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，配制成膠原溶液。另取0.5mol/L的醋酸溶液作為對(duì)照。兩種溶液分別加入1cm的石英比色皿后進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定，選擇波長(zhǎng)范圍為200～400nm，進(jìn)行掃描。

1.2.3 紅外光譜分析

紅外光譜可以檢測(cè)出膠原特有的基團(tuán)吸收峰，已成為膠原分析中一種重要方法。取純化后樣品1～2mg，與一定量KBr置于研缽中，研磨成粉末狀后裝樣，手動(dòng)壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000cm-1區(qū)間掃描，分辨率設(shè)置為4cm-1，掃描40次。

1.2.4 氨基酸分析

采用氨基酸自動(dòng)分析儀，由哈爾濱市農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督測(cè)試中心測(cè)定。檢驗(yàn)方法：采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.2.5 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[10]的方法，采用垂直電泳。10%分離膠，5%濃縮膠，考馬斯亮藍(lán)R250染色。上樣量30μL。

1.2.6 熱收縮溫度(ts)測(cè)定

采用示差掃描量熱儀(differential scanning calorimeter，DSC)測(cè)定。稱取6mg鹿茸膠原放入樣品池，放置DSC儀器的樣品支持器上，調(diào)整好儀器，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，并記錄結(jié)果。采用的測(cè)定溫度范圍為20～200℃，20℃保持1min，從20℃升溫到200℃，升溫速率為5℃/min，200℃保持1min，空白用空的樣品池作為參照。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸膠原紫外光譜分析

由于大多數(shù)蛋白質(zhì)中存在酪氨酸和苯丙氨酸，使其在280nm波長(zhǎng)附近有吸收峰。而所有蛋白質(zhì)由于多肽的存在，在230nm波長(zhǎng)附近有吸收峰。膠原中幾乎不含酪氨酸和苯丙氨酸[11]，因此，純膠原在280nm波長(zhǎng)附近無(wú)吸收峰，在230nm波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收峰。據(jù)此也可檢測(cè)膠原的純度。

圖1 鹿茸膠原紫外吸收光譜Fig.1 UV spectrum of antler collagen

由圖1可知，酶法提取鹿茸膠原在230nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，符合膠原紫外吸收特征[12]。在280nm波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明膠原純度較高。前期對(duì)鹿骨膠原特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰也在230nm波長(zhǎng)處[13]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同；高金龍[14]研究山羊皮中膠原的最大吸收峰在233nm波長(zhǎng)處，其差異可能是由于提取方法和原料氨基酸組成不同造成的。

2.2 鹿茸膠原紅外光譜分析

圖2 鹿茸膠原與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectra of antler collagen and type Ⅰ collagen

由圖2 可知，提取的鹿茸膠原與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原紅外圖譜基本一致。游離的N-H伸縮振動(dòng)在3400～3440cm-1，而當(dāng)N-H參與形成氫鍵，其振動(dòng)頻率降低[15]。因此，鹿茸膠原3424cm-1是由酰胺A帶N-H伸縮振動(dòng)形成的特征吸收峰，表明存在氫鍵，證明有三股螺旋結(jié)構(gòu)的存在。酰胺B出現(xiàn)在2935cm-1，是由C-N伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰。1658cm-1是由酰胺Ⅰ帶C＝O伸縮振動(dòng)形成的特征吸收峰，它是多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)靈敏指標(biāo)。1558cm-1是酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰，它是由N-H彎曲振動(dòng)和C-H伸縮振動(dòng)引起的。1157cm-1是C-N-C振動(dòng)或C-O伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰。紅外圖譜證明，提取的鹿茸膠原為Ⅰ型膠原，且保持良好的結(jié)構(gòu)。

2.3 氨基酸組成分析

表1 鹿茸膠原的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of antler collagen ‰

由表1可知，鹿茸膠原的氨基酸組成中甘氨酸含量最高，約占氨基酸總量的1/3，丙氨酸和脯氨酸含量也較高，酪氨酸、蛋氨酸和組氨酸含量較低，脯氨酸和羥脯氨酸含量為233，高于Su Xiurong等[16]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)I型膠原標(biāo)品(215殘基/1000總殘基)。羥脯氨酸與脯氨酸含量之比為0.75，符合Ⅰ型膠原特征[17]。

2.4 SDS-PAGE電泳分析

由圖3可知，膠原主要含有β鏈及兩條α鏈，即α1和α2，說(shuō)明鹿茸膠原是Ⅰ型膠原。β鏈分子質(zhì)量在200kD以上，α1鏈分子質(zhì)量約為170kD，α2鏈分子質(zhì)量約為160kD。這與之前研究的鹿骨膠原分子質(zhì)量有些差異[13]，可能由于原料來(lái)源不同，其膠原分子質(zhì)量大小也不相同。圖中幾乎不含其他雜帶，表明提取的鹿茸膠原純度較高。

圖3 鹿茸膠原電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of antler collagen

2.5 熱收縮溫度測(cè)定

膠原熱收縮溫度是指蛋白質(zhì)纖維收縮至1/3長(zhǎng)度時(shí)的溫度。在收縮過(guò)程中，膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，氫鍵斷裂，天然的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞[18]。采用Pyris6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和處理得到的DSC曲線，峰值點(diǎn)溫度為熱收縮溫度，曲線形成的峰包括的面積理論上為蛋白質(zhì)變性所吸收能量。鹿茸膠原熱收縮溫度曲線如圖4所示。

圖4 鹿茸膠原熱收縮溫度曲線Fig.4 Thermal transition curve of antler collagen

由圖4可知，鹿茸膠原tS為84.05℃，高于一般脊椎動(dòng)物膠原的tS61.67℃[19]。熱收縮溫度的差異主要與不同物種中膠原亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量、身體溫度及環(huán)境溫度有關(guān)[20]。亞氨基酸的吡咯環(huán)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有固定化作用，以及羥脯氨酸的羥基所形成的氫鍵對(duì)膠原螺旋的穩(wěn)定化起著很大作用[21]。

3 結(jié) 論

梅花鹿鹿茸膠原在230nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)特征峰；其紅外光譜吸收峰與Ⅰ型膠原一致；有典型的膠原的氨基酸組成；膠原分子質(zhì)量較高且分子質(zhì)量分布與I型膠原一致。鹿茸膠原的熱收縮溫度較高。本實(shí)驗(yàn)提取的鹿茸膠原具有較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，具有典型的I型膠原的理化特性。

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Physico-chemical Properties of Sika Deer Antler Collagen

ZHAO Yu-hong，JIN Xiu-ming
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The physico-chemical properties of sika deer antler collagen extracted in acidic solution with pepsin were determined using ultraviolet (UV) spectroscopy, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, amino acid analyzer, SDS-PAGE and differential scanning calorimetry (DSC). A typical absorption peak at 230 nm was found in the UV spectrum. The FTIR spectrum showed that the amide A, B and Ⅰ spectral bands were consistent with those standard typeⅠ collagen with threespiral structure. SDS-PAGE results indicated that sika deer antler collagen was composed of one β-chain and two different αchains (α1 and α2), which were the characteristics of type Ⅰ collagen. Amino acid composition analysis revealed the characteristic amino acids of typeⅠ collagen. The tswas 84.05 ℃. On the basis of the analysis above, it could be concluded that sika deer antler collagen had typical physico-chemical properties of type Ⅰ collagen.

sika deer antler；collagen；macromolecular protein；structural characteristics；physico-chemical properties

Q816

A

1002-6630(2012)11-0075-04

2011-05-27

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)項(xiàng)目(11553036)

趙玉紅(1968—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榱痔禺a(chǎn)品精深加工。E-mail：zhaoyuhong08@hotmail.com