鄭 捷，劉學勤，柳亞靜，劉東岳，曹 蓓，石龍貴，劉安軍

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

雞肉味風味基料中蛋白黑素的初步分析

鄭 捷，劉學勤，柳亞靜，劉東岳，曹 蓓，石龍貴，劉安軍

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

利用雞骨架酶解液為原料，通過美拉德反應制備雞肉味風味基料。通過大小排阻高壓液相色譜對雞肉味風味基料中的蛋白黑素進行分子質量(Mw)分析，發(fā)現(xiàn)其大小約為11561.1D；對使用0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素進行傅里葉變換紅外光譜分析，鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說明蛋白黑素是一類復雜的有機化合物，可能由氨基酸復合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，具體結構仍需深入研究。

雞骨架；酶解物；蛋白黑素；大小排阻高壓液相色譜；傅里葉變換紅外光譜

蛋白黑素是由羰基化合物(一般指糖類)與帶有自由氨基的含氮化合物(如氨基酸、肽、蛋白質等)之間發(fā)生美拉德反應，產(chǎn)物通過進一步環(huán)化、脫水、逆縮、重排、異構化、縮合而形成的一種褐色物質，也稱類黑精[1-2]；蛋白黑素具有抗氧化[3-4]、抗菌[5]、降糖、降壓[6]等生理功能，且其功能性已得到初步驗證。蛋白黑素結構復雜、聚合度不等，是一種復雜的聚合物[7]。在不同反應條件下，不同反應物反應得到的蛋白黑素的組成成分與結構均存在差異。目前，人們也逐漸開始對蛋白黑素的具體組成、分子結構及作用機理展開深入研究。Mundt等[8]對蛋白黑素的組成成分進行了比較研究，結果顯示，蛋白黑素主要由降解反應的產(chǎn)物氨基酸、糖結構片斷、醛等部分組成。Martins等[9]的研究表明，蛋白黑素的形成主要有以下3種途徑：1)低分子質量的有色物質以及低分子質量的發(fā)色物質交聯(lián)蛋白質中Lys和Arg中游離氨基基團；2)呋喃或吡咯通過縮聚反應、氨基酸復合物聚合、交聯(lián)；3)美拉德反應的早期階段的糖降解產(chǎn)物。

在食品加工過程中，蛋白黑素與相關食品的營養(yǎng)有密切關系，其廣泛分布于咖啡、可可、面包、麥芽、蜂蜜等食品中，與人類關系密切。但在熱解蛋白質和氨基酸過程中，有機體突變物質的發(fā)現(xiàn)增加了對這些食物安全性的關注。Taylor等[10]應用Ames、Vitotox和微核實驗對Glu-Lys模型體系產(chǎn)生蛋白黑素的基因毒性進行評價，實驗表明，在正常食用濃度范圍，食品中蛋白黑素無基因毒性，高濃度的低分子質量的蛋白黑素具有毒性。Borrelli等[11]研究發(fā)現(xiàn)可溶性的蛋白黑素有較強的氧化能力，對Caco-2細胞不產(chǎn)生細胞毒性。

本實驗使用大小排阻高壓液相色譜對雞肉味風味基料中蛋白黑素的分子質量進行測定，并使用傅里葉變換紅外光譜對其結構進行分析，初步探索雞肉味風味基料中蛋白黑素的分子結構，為今后進一步就其結構的研究提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞骨架 大成(天津)集團；Flavourzyme諾維信復合風味蛋白酶(1.0×105U/g) 、Protamex蛋白酶(1.2× 105U/g) 丹麥(中國)諾維信公司；中低分子質量標準蛋白質(生化試劑) 美國Sigma公司；丙氨酸(生化試劑)天津顥洋生物制品有限公司；鹽酸(分析純) 天津文達稀貴試劑化工廠；氫氧化鈉(分析純) 天津市北方化玻購銷中心；氯化鈉、葡萄糖等均為分析純 天津江天化工有限公司；各種調味料 天津市塘沽區(qū)樂購超市。

1.2 儀器與設備

ESJ205-4型電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；PHS-3B型精密pH計 上海雷磁儀器廠；TJS12-H絞肉機 廣東恒聯(lián)食品機械有限公司；膠體磨 廊坊通用機械制造有限公司；FJ-200型高速分散均質機 上海標本模型廠；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；LD4-40型低速大容量離心機 北京醫(yī)用離心機廠；Waters 600高效液相分析儀(配有配2487紫外檢測器和M32工作站) 島津(香港)有限公司；Vector 22傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

取一定量的新鮮雞骨架，除皮及油脂，用絞肉機將雞骨架充分絞碎，將其置于120℃、0.1MPa高壓加熱處理20min；加適量的蒸餾水于膠體磨中研磨雞骨顆粒，制得雞骨糜。

1.3.2 雞骨架酶解液的制備

向上述雞骨糜中加入蒸餾水，高速均質混勻配制成25%的雞骨懸浮液，用3mol/L HCl或NaOH調溶液pH值至蛋白酶的最適pH值。置于500mL的燒杯中，采用恒溫水浴鍋維持酶的最適反應溫度55℃，并保證均勻受熱。加入600U/g Flavourzyme風味蛋白酶和360U/g Protamex蛋白酶(以底物蛋白計算)水解反應3h，然后在95℃條件下加熱10min使酶失活終止反應。水解液離心后，保留上清液以備用。

1.3.3 雞肉味風味基料的制備

取40g的雞骨架蛋白酶解液，加入HAP 50g(水解蛋白酶)、1.0g L-半胱氨酸鹽酸鹽、2g味精、0.8g硫胺素、0.5g食鹽、2g丙氨酸、1g木糖、0.5g葡萄糖，120℃進行美拉德反應20min制備雞肉味風味基料。

1.3.4 雞肉味風味基料中蛋白黑素的分析

1.3.4.1 低分子質量標準蛋白分子質量標準曲線的測定

色譜條件[12]：Waters 600 高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和M32工作站)；TSKgelG4000PWXL 色譜柱(300mm×7.8mm，10μm)；流動相：0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；UV220nm檢測器；流速：0.6mL/min；

標準品：兔磷酸化酶B(Mw97.4kD)、牛血清白蛋白(Mw66.2kD)、兔肌動蛋白(Mw43kD)、牛碳酸酐酶(Mw31kD)、胰蛋白酶抑制劑(Mw20.1kD)、雞蛋清溶菌酶(Mw14.4kD)。

1.3.4.2 雞肉味風味基料中蛋白黑素的分離

對蛋白黑素分離、分析的方法主要有等電聚焦、金屬離子親和色譜、凝集素親和層析色譜等方法[13]。目前，在蛋白黑素的制備方面普遍采用的方法是：將美拉德反應的產(chǎn)物 MRPs通過透析、Sephadex、超濾等技術進行分離，即可得到不同相對分子質量范圍的蛋白黑素。

本實驗將雞肉風味基料置于3000D的透析袋中，流水透析48h，然后用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱分離，分別用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液洗脫[14-15]。

1.3.4.3 大小排阻高壓液相色譜(HPSEC)分析蛋白黑素分子質量

大小排阻高壓液相色譜條件同1.3.4.1節(jié)中所述；樣品制備：樣品用微孔過濾膜過濾后，吸取15μL進樣。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜初測結構

將分離出的蛋白黑素凍干后與溴化鉀混勻壓片，置于Vector 22傅里葉變換紅外光譜儀中進行分析。分辨率：4cm-1，掃描次數(shù)：16。

2 結果與分析

2.1 低分子質量標準蛋白分子質量校正曲線的確定

低分子質量標準蛋白大小排阻高壓液相分子凝膠色譜圖如圖1所示，分別選取標準品的保留時間(χ)與分子質量的對數(shù)值(lgMw)為橫縱坐標作出分子質量校正曲線，并得出分子質量校正曲線方程為：lg Mw＝-0.135X＋6.789(R2＝0.943)。

圖1 低分子質量標準蛋白高壓液相分子凝膠色譜圖Fig.1 HPSEC of peptide standards with low molecular weight

2.2 蛋白黑素分子質量的確定

采用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱對雞肉風味基料進行分離(圖2)，用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液洗脫出蛋白黑素。對5種蛋白黑素用大小排阻高壓液相色譜進行分子質量分析，分子質量經(jīng)校正曲線方程計算，發(fā)現(xiàn)其分布在同一范圍內，約為11561.1D。DEAESephadex A-25凝膠顆粒大小為4～120μm，適用于分離小蛋白及巨大分子，5種濃度NaCl洗脫液洗脫出同樣分子質量的樣品，可能是由于樣品分子質量不在凝膠洗脫范圍內，因此僅以其離子強度大小被分離。

圖2 蛋白黑素高壓液相分子凝膠色譜圖Fig.2 HPSEC of melanoidin sample

2.3 蛋白黑素結構的紅外光譜初步測定

選取0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出蛋白黑素，對其進行傅里葉變換紅外光譜分析，紅外光譜圖見圖3。用0.2mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素在3080cm-1處可能存在＝C-H伸縮振動吸收峰，也可能是C-X吸收振動峰(X＝O、N、C、S)。3306、2977、2836cm-1處可能存在C-X吸收振動峰。1651cm-1處存在不對稱烯烴C＝C伸縮振動吸收峰，980cm-1處存在＝C-H面外彎曲振動吸收峰，3306cm-1處存在末端炔烴＝C-H伸縮振動吸收峰，1723cm-1處存在C＝O伸縮振動吸收峰。0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素在波數(shù)2925cm-1處存在C-H甲基和亞甲基伸縮振動吸收峰，1641cm-1處存在不對稱烯烴C＝C伸縮振動吸收峰，928cm-1和858cm-1處存在末端烯烴＝C-H面外彎曲振動吸收峰，1384cm-1處存在C-H甲基和亞甲基剪切振動吸收峰。

圖3 0.2mol/L(A)和0.5mol/L(B)NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of melanoidin eluted by 0.2 mol/L and 0.5 mol/L NaCl solutions

本實驗鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說明蛋白黑素是一類復雜的化合物，有可能是由氨基酸復合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，其具體結構需進一步檢測才能得出。

3 結 論

實驗利用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱分離雞肉味風味基料中的蛋白黑素，并使用大小排阻高壓液相色譜對其進行分子質量分析得出其分子質量約為11561.1D；對使用0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素進行傅里葉變換紅外光譜分析，鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說明蛋白黑素是一類復雜的有機化合物，有可能是由氨基酸復合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，具體結構仍需深入研究。

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Preliminary Analysis of Melanoidin in Chicken Flavor Matrix

ZHENG Jie，LIU Xue-qin，LIU Ya-jing，LIU Dong-yue，CAO Bei，SHI Long-gui，LIU An-jun
(College of Food Science and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Chicken bone hydrolysate was used to prepare chicken flavor matrix via Maillard reaction in this work. The molecular weight of melanoidin in the prepared flavor matrix was determined to be approximately 11561.1 D by size-exclusion highperformance liquid chromatography(HPSEC). The FT-IR results revealed that melanoidin fractions separated by 0.2 mol/L and 0.5 mol/L NaCl solutions had characteristic absorption peaks of C—H, C＝O and C—N, suggesting that melanoidin in chicken flavor matrix was organic compound formed by polymerization and cross-linking of amino acid mixtures and degraded products in an early stage of Maillard reaction. The structure of melanoidin needs to be further investigated.

chicken bone ；protein hydrolysates；melanoidin；size exclusion high performance liquid chromatography；fourier transform infrared spectroscopy

TS251.94

A

1002-6630(2012)11-0066-04

2011-06-17

天津市農業(yè)科技成果轉化與推廣項目(201002090)；天津市科技成果轉化及產(chǎn)業(yè)化推進計劃項目(09ZHXHNC04900)；天津東麗科委科技成果轉化項目(2010301；2010303)

鄭捷(1972—)，女，高級工程師，碩士，研究方向為水產(chǎn)品、畜產(chǎn)(副產(chǎn))品高附加值的開發(fā)利用及功能性食品。E-mail：jane@tust.edu.cn