蘆紅艷，李妍妍，王 奇，王 霞，蘇秀榕,*

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

鮟鱇魚骨對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的影響

蘆紅艷1，李妍妍2，王 奇1，王 霞1，蘇秀榕1,*

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

目的：通過研究鮟鱇魚骨粉對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用，確定鮟鱇魚加工下腳料的使用價(jià)值，方法：雌性SD大鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(乳酸鈣1000mg/(kg·d))及魚骨高(6636mg/(kg·d))、中(2100mg/(kg·d))、低(665mg/(kg·d))3個(gè)劑量組。手術(shù)后12d，持續(xù)灌胃12周后，測(cè)定股骨長度、股骨質(zhì)量、子宮形態(tài)以及血清中Ca、P和堿性磷酸酶(APL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平。結(jié)果：各劑量組大鼠與模型對(duì)照相比股骨質(zhì)量升高，所有大鼠的股骨長度、血清Ca和血清P水平差異無顯著性，模型對(duì)照組的血清堿性磷酸酶水平APL、AST、ALT與假手術(shù)組相比明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，而各劑量組的APL、AST、ALT水平與假手術(shù)組差異不顯著。同時(shí)各劑量組可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育和內(nèi)膜上皮無纖毛細(xì)胞上的微絨毛生長。結(jié)論：鮟鱇魚骨可改善去卵巢大鼠的血清生化指標(biāo)，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育和內(nèi)膜上皮無纖毛細(xì)胞上的微絨毛生長。

鮟鱇魚骨；去卵巢大鼠；子宮形態(tài)；生化指標(biāo)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與老年性骨質(zhì)疏松也稱為原發(fā)性骨質(zhì)疏松，是代謝性骨病中最常見的疾病，常見于40歲以上的中年人和老年人，女性比男性更為常見[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(post menopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退，雌激素明顯減少，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成而產(chǎn)生，以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折的全身性疾病[2]。

鮟鱇魚(Lophius litulon)，俗稱蛤蟆魚、海蛤蟆，屬軟骨魚類，鮟鱇目(Lophiiformes)、鮟鱇科(Lophiidae)，其資源主要分布在我國東海北部、黃海和南海。目前鮟鱇魚主要用于加工后魚肉和魚肝的出口，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生近60%的下腳料，而魚骨約占下腳料的15%，如不進(jìn)行加工處理，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。由于鮟鱇魚生活于深海，其食物由天然環(huán)境中取得，沒有受到有害藥物等污染，魚骨中含有豐富的Ca和比例適當(dāng)?shù)腜，可作為人類理想的Ca源，魚骨的Ca主要是磷酸鈣，含量約58%～62%，其組成很接近人體骨骼，是制取食品級(jí)磷酸氫鈣的原料之一。本實(shí)驗(yàn)以鮟鱇魚骨為原料，研究其對(duì)去卵巢大鼠的股骨長度、干質(zhì)量、以及血清中Ca、P和堿性磷酸酶的含量，借以模擬對(duì)人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響。

1 材料與方法

雌性SD大鼠(250±2)g 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

鮟鱇魚骨，購于舟山附近海域，冷藏狀態(tài)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)高壓、粉碎制得粉末后，制成鮟鱇魚骨粉，再用膠體磨將其制成懸浮液。

Ca試劑盒、P試劑盒、堿性磷酸酶(APL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒 寧波美康生物科技有限公司。

S-3400N掃描電鏡、7020全自動(dòng)生化分析儀 日本日立儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模

“打！”底柱一聲吼，身邊輕重機(jī)槍，沖鋒槍，三八式，中正式響成一片，那邊鬼子也是邊打邊沖，這些訓(xùn)練有素的家伙，哪怕是沖鋒的時(shí)候準(zhǔn)頭也一點(diǎn)不減，塹壕里不時(shí)有弟兄被打爆了頭，同樣也是腦漿飛濺得四處都是。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組，手術(shù)前禁食12h。以30mg/kg的劑量腹腔注射2g/100mL 戊巴比妥鈉溶液，麻醉后手術(shù)組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除，假手術(shù)組(N組)只切除卵巢周圍相同質(zhì)量的脂肪。手術(shù)后肌肉注射8萬單位的青霉素，連續(xù)3d。

1.2.2 分組與給藥

卵巢切除12d后將手術(shù)組隨機(jī)分為5組：每組各10只，即模型組(M組)、陽性對(duì)照組(Q組1000mg/(kg·d)乳酸鈣)、鮟鱇魚骨高劑量組(C1組，6636mg/(kg·d))、中劑量組(C2組，2100mg/(kg·d))、低劑量組(C3組，665mg/(kg·d))，實(shí)驗(yàn)期間，各組自由進(jìn)食水，室溫保持25℃左右，光照晝夜間隔12h。每周稱體質(zhì)量一次，連續(xù)灌胃魚骨懸浮液及乳酸鈣溶液12周。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)

子宮內(nèi)膜形態(tài)：第90天，處死大鼠，取出子宮稱質(zhì)量，并固定于2.5%戊二醛溶液中，掃描電鏡觀察內(nèi)膜上皮。

血清生化指標(biāo)：各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，3000r/min離心，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清Ca、P含量及APL、AST及ALT水平。

股骨：大鼠處死后，剝離右股骨，測(cè)量股骨長度，再經(jīng)105℃烘烤8h，稱質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以χˉ±s表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS進(jìn)行方差分析，用兩組樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)比較組間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)及子宮系數(shù)

2.1.1 子宮內(nèi)膜形態(tài)

掃描電鏡可見，與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組子宮內(nèi)膜上皮表面扁平且皺劈不明顯，腺體開口數(shù)量明顯減少，無纖毛細(xì)胞表面被覆微絨毛極少(圖1a、b)。與模型對(duì)照組相比，攝入陽性藥及鮟鱇魚骨的大鼠，子宮內(nèi)膜表面褶皺和腺體開口數(shù)量明顯增加，且微絨毛長度和覆蓋面積均顯著提高(圖1c、d)。

圖1 電鏡掃描子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)(×2000)Fig.1 Effects of Lophius litulon bone on uterine luminal surface ultrastructure in rats as observed under scanning electron microscops(×2000)

2.1.2 子宮系數(shù)測(cè)定結(jié)果

由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組子宮的形態(tài)明顯萎縮，質(zhì)量明顯減少，此外，C1、C2、C3劑量組的子宮質(zhì)量較模型組明顯增大，其中，C1組高于陽性對(duì)照組，且趨近于假手術(shù)組，各實(shí)驗(yàn)組呈量效關(guān)系。

表1 各組大鼠子宮系數(shù)Table 1 Effect of Lophius litulon bone on uterus coefficient in rats

表2 大鼠Ca、P含量及血清堿性磷酸酶活力Table 2 Effect of Lophius litulon bone on serum levels of Ca, P and ALP in rats

2.2 大鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表2可見，各組大鼠的血Ca和血P水平與假手術(shù)組相比，差異不顯著，卵巢摘除和鮟鱇魚骨對(duì)血Ca和血P水平?jīng)]有影響。同時(shí)，模型對(duì)照組大鼠的ALP、ALT與AST水平與假手術(shù)組相比，有顯著性差異(P＜0.01)，灌胃魚骨粉后，各實(shí)驗(yàn)組ALP、ALT與AST水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中C1組作用最顯著，C2組的水平與模型組相比有降低趨勢(shì)，并趨近假手術(shù)組水平，高劑量組的效果要優(yōu)于低、中劑量組。2.3大鼠股骨的測(cè)定

表3 大鼠股骨長度及質(zhì)量Table 3 Effect of Lophius litulon bone on femoral length and weight in rats

由表3可見，摘除卵巢可使大鼠的股骨質(zhì)量減少，模型組與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.05)。各劑量組的股骨質(zhì)量較模型組升高，且都高于陽性對(duì)照組，其中C1組與模型組比較有極顯著性差異(P＜0.01)，并與C2、C3組成量效關(guān)系。各組大鼠間股骨長度無顯著性差異。

3 討 論

3.1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立

雌激素主要是由卵巢產(chǎn)生及釋放的，其可以使子宮內(nèi)膜增生，腺體增多，功能層增厚。婦女絕經(jīng)后，卵巢功能衰退，雌激素分泌減少，相應(yīng)的引起生殖道的變化，使子宮萎縮，同時(shí)，松質(zhì)骨的骨量減少，骨強(qiáng)度下降，并伴有骨轉(zhuǎn)換率增加[3]。Hidaka等[4]研究中藥對(duì)去卵巢大鼠子宮的影響中提到，雌激素直接影響子宮質(zhì)量，子宮萎縮是卵巢成功摘除的典型標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢大鼠模擬絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松癥，大鼠摘除卵巢后，模型對(duì)照組子宮明顯萎縮，子宮質(zhì)量也明顯減小，說明骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功。

3.2 血清生化指標(biāo)的變化

Ca、P平衡受甲狀旁腺素、降鈣素等多種因素的調(diào)節(jié)和控制。本研究建立了骨質(zhì)疏松模型并證實(shí)了鮟鱇魚骨對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用，但各組大鼠的血Ca和血P水平無顯著性差異，所以其不能作為反應(yīng)骨質(zhì)疏松的特異性指標(biāo)。

血清中的ALP主要來自骨和肝，骨ALP與成骨細(xì)胞活性有關(guān)，ALP的上升說明了成骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)[5]，由于去卵巢模型是高轉(zhuǎn)換型骨代謝[6]，骨吸收大于骨形成導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，本研究中ALP的變化符合去卵巢模型的特點(diǎn)。一般認(rèn)為ALP的升高是伴隨著骨吸收的亢進(jìn)而出現(xiàn)的代償性骨形成增加引起的[7]。實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組ALP水平明顯升高，說明骨吸收亢進(jìn)，骨更新加速，代償性骨形成增加，給藥后，ALP水平恢復(fù)到正常水平，因此，ALP可以作為骨質(zhì)疏松的特異性指標(biāo)。脂肪肝發(fā)病一般認(rèn)為與體內(nèi)脂肪代謝異常密切相關(guān)，同時(shí)，脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞之間脂肪代謝平衡的失調(diào)也會(huì)增加脂肪肝的發(fā)病率[8-9]，ALT、AST存在于肝細(xì)胞的細(xì)胞核及線粒體中，肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT、AST釋放入血，導(dǎo)致血清中的含量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去卵巢大鼠攝入魚骨粉后，與模型對(duì)照組比較，ALT、AST水平顯著降低，并與劑量呈正相關(guān)性。可見，鮟鱇魚骨懸浮液能顯著降低去卵巢大鼠血清ALT、AST活性。

3.3 鮟鱇魚骨對(duì)子宮的作用

程妍等[10]研究了牦牛營養(yǎng)粉能顯著改善大鼠骨質(zhì)，且不會(huì)對(duì)血清生化指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。龔海洋等[11]對(duì)乳酸鈣防治骨質(zhì)疏松進(jìn)行了研究，并且證明乳酸鈣具有抑制骨吸收作用。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)去卵巢大鼠灌胃魚骨懸浮液后，其能使大鼠子宮質(zhì)量明顯增加，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育和內(nèi)膜上皮無纖毛細(xì)胞上的微絨毛生長。其對(duì)骨質(zhì)疏松的防治機(jī)理可能是改變了雌激素或雌激素受體的活性[12]。鮟鱇魚為軟骨魚類，魚骨中含有硫酸軟骨素，陽春華等[2]研究了硫酸軟骨素加Ca對(duì)去卵巢切除大鼠骨密度和骨Ca含量的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素加Ca不僅能有效抑制雌激素缺乏所誘發(fā)的骨丟失，而且能明顯增加骨密度。因此鮟鱇魚骨可作為一種良好的Ca制劑來源。

[1]支英杰, 謝雁鳴. 中醫(yī)藥對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥雜志, 2010, 51(1): 241-243.

[2]陽春華, 胡余明, 易傳祝. 硫酸軟骨素加鈣對(duì)卵巢切除大鼠骨密度和骨鈣含量的影響[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2008, 15(4): 1053-1054.

[3]WRONSKI T J, WALSH C C, IGNASZEWSKI L A. Histologic evidence for osteopenia and increased bone turnover in ovariectomized rats [J]. Bone, 1986, 7: 119-124.

[4]HIDAKA S, OKAMOTO Y, NAKAJIMA K, et al. Preventive effects of traditional Chinese (Kampo) medicines on experimental osteoporosis induced by ovariectomy in rats[J]. Calcif Tissue Int, 1997, 61: 239-246.

[5]陳新軍, 霍維玲, 李香業(yè), 等. 聯(lián)合檢測(cè)尿脫氧吡啶啉與骨源性堿性磷酸酶診斷骨質(zhì)疏松癥[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2006, 24(4): 253-254.

[6]PEDERSOR L, KREMER M. Evidence of a correlation of estrogenreceptor level and avian osteoclast estrogen responsiveness[J]. J Bone Miner Res, 1997, 12(2): 742-752.

[7]霍乃蕊, 馬儷珍, 忻欣, 等. 羊骨酶解發(fā)酵液螯合物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨代謝生化指標(biāo)的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2010, 18 (3): 216-219.

[8]CHEN Jiaming, SONG Wu, REDINGER R. Effects of dietary cholesterol on hepatic production of lipids and lipoproteins in isolated hamster liver[J]. Hepatology, 1996, 24: 424-434.

[9]BACHMAN A L, DUBINM D, MOUKARZEL A A. Choline deficiency, acause of hepatic steatosis during parenteral nutrition that can be reverse with intravenous choline supplementation[J]. Hepatology, 1995, 22: 1399-1403.

[10]程妍, 余群力, 趙莉, 等. 牦牛骨營養(yǎng)粉對(duì)大鼠骨密度及血清生化指標(biāo)的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(9): 204-206.

[11]龔海洋, 李文燦, 盧承前, 等. 乳酸鈣防治實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松的研究[J].衛(wèi)生研究, 1998, 27(6): 402-404.

[12]CLARK R C, TARTTELIN M F. Some effects of ovariectomy and estrogen replacement on body composition in the rat[J]. Physiol Behav, 1982, 28(6): 963-969.

Effects of Lophius litulon Bone in Ovariectomized Rats with Osteoporosis

LU Hong-yan1，LI Yan-yan2，WANG Qi1，WANG Xia1，SU Xiu-rong1,* (1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Purpose: To find out the effect of Lophius litulon bone on osteoporosis in ovariectomized rats. Methods: Sixty SD female rats were divided at random into six groups: sham-operation group, model control group, positive control group [1000 mg/(kg·d) calcium lactate] and low-, medium- and high-dose treatment groups [at the doses of 665, 2100 mg/(kg·d) and 6636 mg/(kg·d), respectively]. At 12 days after ovariectomy, the rats were administrated for 12 consecutive weeks and then killed for the determination of femoral length and weight, uterus shape, and the serum levels of Ca, P, APL, AST and ALT. Results: The three treatment groups showed an increase in femoral weight compared with the model control group, but no significant difference in femoral length and the serum levels of P and Ca was observed. The serum levels of APL, AST and ALT in the model control group were significantly higher those of the sham-operation group, but no significant difference existed among the treatment groups and sham-operation group. In addition, each treatment group could promote endometrial gland development and microvillar growth in endometrial gland nonciliated epithelial cells. Conclusion: Lophius litulon bone can improve the serum biochemical indices and promote microvillar growth in endometrial gland nonciliated epithelial cells.

Lophius litulon bone；ovariectomized rat；uterus shape；biochemical indices

TS254.9

A

1002-6630(2012)03-0252-04

2011-05-16

寧波市科技局農(nóng)業(yè)與社發(fā)領(lǐng)域重大科技項(xiàng)目(2010C03017-1)；寧波市重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(B01345104900)作者簡介：蘆紅艷(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：magiclhy@163.com

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程，生化與分子生物學(xué)。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn