郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛(wèi)玲

(1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871)

叔丁基對苯二酚兩種代謝物的代謝動力學(xué)

郝鵬鵬1，倪晉仁2，孫衛(wèi)玲2

(1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871)

目的：研究叔丁基對苯二酚(TBHQ)在Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)的兩種代謝物叔丁基對苯二酚-硫酸結(jié)合物和叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物的代謝動力學(xué)特征。方法：大鼠灌胃不同劑量叔丁基對苯二酚后，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分別對兩種代謝物在不同時間點血清中的濃度進(jìn)行半定量分析，并運用實用藥代動力學(xué)軟件進(jìn)行房室模型擬合及代謝動力學(xué)參數(shù)計算。結(jié)果：兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)過程均呈一級動力學(xué)特征，符合二室模型。結(jié)論：灌胃后，叔丁基對苯二酚-硫酸結(jié)合物、叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)達(dá)到峰值濃度的時間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h，分布相半衰期分別為0.32～1.11h、0.26～2.60h，消除相半衰期分別為11.75～24.54h、24.42～55.78h。雄性大鼠血清中兩種代謝物的濃度顯著高于雌性大鼠。兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，隨著劑量的升高，叔丁基對苯二酚在大鼠體內(nèi)的代謝飽和。

叔丁基對苯二酚-硫酸結(jié)合物；叔丁基對苯二酚-葡萄糖醛酸結(jié)合物；代謝動力學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)是一種廣泛應(yīng)用于油脂食品的合成酚類抗氧化劑(synthetic phenolic antioxidants，SPAs)。然而，其安全性評價結(jié)論一直存在爭議，體內(nèi)實驗[1-2]和體外實驗[3-7]顯示TBHQ具有一定的毒性。此外，體內(nèi)代謝研究發(fā)現(xiàn)TBHQ在體內(nèi)的代謝物有TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物、TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物和叔丁基對苯醌(2-tert-butyl-1,4-benzoquinone，TBQ)等[1,6,8]。其中，TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物已被發(fā)現(xiàn)對腎臟和膀胱有毒[9]，TBQ和TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物都具有細(xì)胞毒性[6,10]因此，TBHQ在食品中的添加引起社會廣泛關(guān)注[11]。目前，很多國家對其使用加以限制，我國規(guī)定TBHQ在食品中的最大添加量為200mg/kg[12]，而日本則不允許在食品中使用TBHQ[13]。

本實驗擬運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立檢測大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的分析方法，探討兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)過程，為深入研究TBHQ及其代謝物的毒作用性質(zhì)進(jìn)而評價TBHQ的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年Sprague-Dawley大鼠，雌性和雄性，體質(zhì)量(160±10)g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部，合格證號SCXK(京)2002-0003。

TBHQ標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度98.0%) 德國J&K Chemica公司；TBHQ(食品級，純度＞96.0%) 廣州泰邦食品添加劑有限公司；甲醇(色譜純) 美國Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP 1100 LC-MSD Trap SL System高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(diode-array detector，DAD)、電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)美國Agilent公司；BP210S、BP211D電子分析天平德國Sartorius公司；MILLI-Q GRADIENT SYSTEM超純水機(jī) 美國Millipore公司；WH-90A型微型混合器上海亞榮生化儀器廠；TGL-16C型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 劑量與樣品采集

FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)規(guī)定每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)為0～0.7mg/kg[6]。動物對毒性的耐受力比人強(qiáng)，約為人的1～10倍[14]。因此，選取7mg/kg作為低劑量。TBHQ的口服半致死量(LD50)為700～1000mg/kg[1]，因此選用700mg/kg作為高劑量。中等劑量選取低劑量和高劑量的中間值，定為350mg/kg。

雌、雄大鼠各24只，每6只一組，隨機(jī)分組：雌鼠A、B、C、D組和雄鼠A、B、C、D組。A組為空白對照組，以1mL玉米油灌胃；B、C、D組的劑量分別為7、350、700mg/kg，以1mL玉米油溶解后灌胃。大鼠灌胃后，分別于0.08、0.25、0.5、1、2、3、5、7、9、12、24、48h尾靜脈采血0.2mL。所采血樣放在冰盒中，置于4℃冰箱。

1.4 樣品前處理

空白血清：空白血樣在12000r/min離心20min，移取上清液到1.5mL具塞離心管中，即為空白血清。

血清供試品溶液：血樣在12000r/min離心20min，移取上清液100μL到1.5mL具塞離心管中，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入200μL甲醇，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取100μL上清液至內(nèi)置100μL內(nèi)插管的液相色譜進(jìn)樣瓶內(nèi)進(jìn)行檢測。

血清標(biāo)準(zhǔn)溶液：用空白血清配制TBHQ質(zhì)量濃度分別為49、228、581、1372、2515、5030μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100μL超純水，于微型混合器上振蕩1min，加入1mL乙酸乙酯，于微型混合器上振蕩3min，12000r/min離心20min，移取800μL萃取液至1.5mL離心管中，在25℃條件下由氮氣緩慢吹干，100μL甲醇定容，轉(zhuǎn)移至放有100μL內(nèi)插管的液相色譜進(jìn)樣瓶內(nèi)，即得TBHQ血清標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1mm× 150mm，5μm)，柱溫30℃，流動相為甲醇-水(體積比為60:40)，流速0.15mL/min，進(jìn)樣體積5μL，檢測波長290nm，停止時間25min。

質(zhì)譜條件：碰撞氣為氦氣，霧化氣和干燥氣為氮氣，霧化氣壓力30psi，干燥氣流速10L/min，干燥氣溫度280℃，毛細(xì)管電壓3000V，負(fù)離子檢測模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。

1.6 動力學(xué)模型計算

運用實用藥代動力學(xué)軟件(practical pharmacokinetic program-version 97，中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)專業(yè)委員會編制)分別對TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠血清中的平均濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，并估算各代謝動力學(xué)參數(shù)值，采用Excel軟件進(jìn)行t檢驗或相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的檢測

圖1 一級質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of rat serum and extracted ion chromatograms of TBHQ, TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在所采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件下，TBHQ的保留時間為5.3min(圖1)，分子離子為m/z 165，二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑詳見文獻(xiàn)[15]；TBHQ-硫酸結(jié)合物的保留時間為3.4min (圖1)，分子離子為m/z 245，二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 165、m/z 81，對m/z 165作三級質(zhì)譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑見圖2A；TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的保留時間為3.4min(圖1)，分子離子為m/z 341，二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 113、m/z 165和 m/z 175，對m/z 165作三級質(zhì)譜，主要碎片離子為m/z 149、m/z 108，質(zhì)譜裂解途徑見圖2B。

圖2 TBHQ-硫酸結(jié)合物(A) 和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物(B)的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 MS fragmentation pathways of TBHQ-sulfate and TBHQ-glucuronide

在研究TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的體內(nèi)動力學(xué)過程時，與血清中濃度的絕對值相比，更為關(guān)注的是血清中濃度的相對變化。因此，在沒有代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下，利用TBHQ標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對大鼠血清中兩種代謝物的質(zhì)量濃度作半定量分析。質(zhì)量濃度范圍為49～5030μg/L時，以TBHQ的一級質(zhì)譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，TBHQ的質(zhì)量濃度(χ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y＝703χ＋3582 (R2＝0.9935)，依據(jù)該方程和TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的一級質(zhì)譜峰面積分別求質(zhì)量濃度，由此得出大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的平均濃度-時間曲線(圖3、4)。此外，當(dāng)灌胃劑量為700mg/kg時，雄性大鼠(n＝6)組有2只灌胃1～2h后死亡，雌性大鼠(n＝6)組則沒有死亡現(xiàn)象，據(jù)此推斷雌性大鼠對TBHQ的耐受能力更強(qiáng)。

圖3 血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物的平均濃度-時間曲線Fig.3 Mean concentration-time profiles of TBHQ-sulfate in rat serum

圖4 血清中TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的平均濃度-時間曲線Fig.4 Mean concentration-time profiles of TBHQ-glucuronide in rat serum

2.2 大鼠血清中TBHQ兩種代謝物的代謝動力學(xué)

分別對TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠血清中的平均濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明：兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝過程均符合一級吸收速率的二室模型，回歸系數(shù)(R2)分別為0.82～0.98、0.75～0.99。動力學(xué)方程為c＝Aeˉαt＋Beˉβt(A＋B)eˉKat。其中，c為TBHQ在大鼠血清中的濃度，α為分布速率常數(shù)，β為消除速率常數(shù)，A為α相在縱軸的截距，B為β相在縱軸的截距，Ka為一級吸收速率常數(shù)，t為時間。大鼠體內(nèi)TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的主要代謝動力學(xué)參數(shù)值分別見表1、2。

表1 TBHQ-硫酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)的主要代謝動力學(xué)參數(shù)Table 1 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-sulfate in rat serum

表2 TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物在大鼠體內(nèi)的主要代謝動力學(xué)參數(shù)Table 2 Main metabolic kinetic parameters of TBHQ-glucuronide in rat serum

3 討 論

灌胃后，TBHQ在大鼠體內(nèi)代謝生成TBHQ-硫酸結(jié)合物(t1/2Ka為0.04～0.26h)和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物(t1/2Ka為0.08～0.36h)；當(dāng)時間分別為0.17～0.61h、0.23～0.74h時，兩種代謝物在血液中的濃度達(dá)到峰值；并且，從血液分布到體內(nèi)其他組織或器官中(t1/2α(TBHQ-硫酸結(jié)合物)為0.32～1.11h、t1/2α(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)為0.26～2.60h)；最終，兩種代謝物從血液中消除(t1/2β(TBHQ-硫酸結(jié)合物)為11.75～24.54h、t1/2β(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)為24.42～55.78h)。

當(dāng)灌胃劑量為7、350、700mg/kg時，分別對大鼠血清中TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的濃度進(jìn)行性別差異分析，t檢驗結(jié)果均為P＜0.01。因此，在TBHQ的體內(nèi)代謝過程中，大鼠血清中兩種代謝物的濃度存在著顯著性性別差異，雄性大鼠體內(nèi)兩種代謝物的濃度均高于雌性大鼠。該差異是造成高劑量時雄性大鼠出現(xiàn)死亡的原因之一，仍需進(jìn)一步的毒理實驗驗證。

運用Power模型[16]討論TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的體內(nèi)暴露濃度(cmax)與劑量(c)間的關(guān)系，公式為lncmax=a＋blnc，c為劑量，b為體內(nèi)暴露濃度-劑量的比例常數(shù)，b=1表示體內(nèi)暴露濃度與劑量呈正比。經(jīng)估算，在雌性、雄性大鼠體內(nèi)，b(TBHQ-硫酸結(jié)合物)值分別為0.78、0.83，b(TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物)值分別為0.51、0.64。因此，當(dāng)灌胃劑量從7mg/kg增至700mg/kg時，兩種代謝物在大鼠體內(nèi)的暴露濃度均以低于與劑量呈正比的方式增加，劑量升高時，TBHQ的代謝反應(yīng)受到參與反應(yīng)的酶或底物的限制而出現(xiàn)代謝飽和現(xiàn)象。

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Metabolic Kinetics of Two Metabolites from Tertiary Butylhydroquinone

HAO Peng-peng1，NI Jin-ren2， SUN Wei-ling2
(1. School of Safety and Environmental Engineering, Capital University of Economics and Business, Beijing 100070, China；2. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China)

Objective: The metabolic kinetics of two metabolites from tertiary butylhydroquinone, tertiary butylhydroquinonesulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide were investigated in rats. Methods: The concentrations of the metabolites in the serum of rats after oral exposure of tertiary butylhydroquinone were semi-quantitatively analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Compartment model and metabolic kinetic parameters were evaluated by practical pharmacokinetic program. Results: The serum concentration-time profiles of two metabolites could be fitted with a two-compartment model and obeyed first-order kinetics. Conclusion: After oral administration of tertiary butylhydroquinone, the peak time of tertiary butylhydroquinone-sulfate and tertiary butylhydroquinone-glucuronide in the serum of rats were 0.17ˉ0.61 h and 0.23ˉ0.74 h, the distribution half-lives 0.32ˉ1.11 h and 0.2ˉ2.60 h, and the elimination half-lives 11.75ˉ24.54 h and 24.42ˉ55.78 h, respectively. The concentrations of two metabolites in the serum of male rats were higher than those in female rats. The exposure of two metabolites increased in a less-than-dose-proportional manner. Moreover, the metabolism of tertiary butylhydroquinone in rats reached saturation with increasing dose.

tertiary butylhydroquinone-sulfate；tertiary butylhydroquinone-glucuronide；metabolic kinetics；liquid chromatography-mass spectrometry

TS201.6；TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0220-05

2011-03-16

郝鵬鵬(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食品安全、環(huán)境衛(wèi)生。E-mail：haopengpeng@gmail.com