許龍巖，袁慕云，林文麗，張 旺，焦 紅

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510623)

DiversiLab系統(tǒng)沙門(mén)氏菌分子分型評(píng)價(jià)

許龍巖，袁慕云，林文麗，張 旺，焦 紅

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510623)

目的：評(píng)價(jià)DiversiLab(DVL)系統(tǒng)對(duì)沙門(mén)氏菌(SA)的分型能力。方法：用rep-PCR技術(shù)為原理的DVL系統(tǒng)對(duì)進(jìn)出口食品中分離的44株SA進(jìn)行分子分型，并與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)結(jié)果比較，探討DVL對(duì)SA的種群分類(lèi)能力和分辨率。結(jié)果：44株SA經(jīng)rep-PCR分型分成22個(gè)群，分離自不同國(guó)家、不同食品中的相同血清型SA分布在同一個(gè)群，而且菌株之間相似性非常高。在rep-PCR結(jié)果中分在同一個(gè)群中的SA，在PFGE結(jié)果中除SA2和SA15外，其他菌株之間相關(guān)性較低。結(jié)論：DVL在SA的種群的分類(lèi)能力上優(yōu)于PFGE，但分辨率低于PFGE。

沙門(mén)氏菌；DiversiLab系統(tǒng)；rep-PCR；PFGE；分子分型

基因外重復(fù)回文序列(repetitive ext ragenic palindrome，rep)在細(xì)菌基因組中存在著菌株、種、屬水平上的分布和拷貝數(shù)量的差異，而序列本身在進(jìn)化過(guò)程中又具有較強(qiáng)的保守性，非常適合作為PCR引物的擴(kuò)增對(duì)象。在rep的中心有一段保守性很高的重復(fù)序列，根據(jù)這段重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增兩段rep之間的片段，發(fā)展出了rep-PCR技術(shù)[1]。DiversiLab(DVL)是以rep-PCR技術(shù)為原理的自動(dòng)化的分子分型系統(tǒng)。本研究用DVL對(duì)食品中分離的沙門(mén)氏菌進(jìn)行rep-PCR分型，并與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)結(jié)果相比較，探討DVL對(duì)SA的分型能力，為DVL應(yīng)用于SA的溯源工作提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

進(jìn)出口食品中分離的SA 44株，菌株信息見(jiàn)表1。上述菌株為廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所保存菌株，所有菌株均經(jīng)過(guò)API 20E生化鑒定確定為SA。PFGE相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用布倫登盧普(Braenderup)沙門(mén)氏菌H9812，由廣東省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送。

1.2 試劑與儀器

API 20E、rep-PCR試劑盒、微流體芯片 法國(guó)梅里埃公司；限制性?xún)?nèi)切酶Xba I 美國(guó)Promega公司；蛋白酶K 德國(guó)Merck公司；SeaKem Gold瓊脂糖、SLS(Sodium lauroyl Sarcosine)、SDS、EDTA 美國(guó)Sigma公司。

Agilent Bioanalyzer 2100型DVL分型系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司；PTC-200型PCR儀、CHEF MAPPER脈沖場(chǎng)電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

圖1 44株沙門(mén)氏菌rep-PCR分子分型樹(shù)狀圖和矩陣圖Fig.1 Dendrogram and matrix diagram constructed by rep-PCR molecular typing

表1 44株沙門(mén)氏菌菌株信息Table 1 Details of 44 Salmonella isolates investigated in this study

1.3.1DNA提取

刮取血瓊脂平板上分離純化的SA菌落，使用DVL配套核酸提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)推薦步驟提取DNA，DNA質(zhì)量濃度控制在25～50ng/μL。

1.3.2rep-PCR分型

以提取的SA DNA為模版，使用DVL 配套的rep-PCR試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃、2min；94℃、30s，50℃、30s，70℃、90s，35個(gè)循環(huán)；72℃、3min，反應(yīng)體積為25μL。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物注入微流體芯片放入DVL系統(tǒng)進(jìn)行電泳，DVL自動(dòng)生成分析報(bào)告，包括聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖、菌株之間相似度。DVL根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)確定菌株間的距離矩陣，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(Upgma法)建立樹(shù)狀圖。

1.3.3rep-PCR分型與PFGE分型比較

44株SA中選24株進(jìn)行PFGE，PFGE方法按文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。限制性?xún)?nèi)切酶用XbaⅠ。產(chǎn)生的電泳圖用BioNumerics軟件構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.144 株SA rep-PCR分型結(jié)果

44株SA 經(jīng)rep-PCR分型分成22個(gè)群，由圖1可見(jiàn)，分離自不同國(guó)家、不同食品中的相同血清型的SA分布在同一個(gè)群，而且菌株之間相似性非常高。鼠傷寒沙門(mén)氏菌SA4、SA6、SA27、SA31、SA36分別從歐洲凍豬肚、廣東凍雞、歐洲豬舌、丹麥凍豬后腳、廣東羅非魚(yú)中分離，5株SA在聚類(lèi)圖上分布在第4群，而且菌株之間的相似度在97%～99%。不同時(shí)間從歐洲凍豬肚中分離的德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2、SA5、SA29 和廣東凍豬肚中分離的SA15分布在第2群，菌株之間相似度在95.1%～97.9%。相同的現(xiàn)象在其他血清型SA中也發(fā)現(xiàn)，烏普沙拉沙門(mén)氏菌SA10、SA11、SA13分布在第6群；阿貢納沙門(mén)氏菌SA1、SA16、 SA35分在第1群，菌株之間相似度97.8%～98.5%；姆班達(dá)卡沙門(mén)氏菌SA22和SA23分布在第5群，伊斯坦布爾沙門(mén)氏菌SA18、SA38分布在第20群。

2.2SA rep-PCR與PFGE分型結(jié)果比較

24株SA經(jīng)PFGE，根據(jù)電泳產(chǎn)生的條帶位置和數(shù)量的不同，共分為22個(gè)PFGE型，帶型較分散。由圖2可見(jiàn)，德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA15、SA2和烏普薩拉沙門(mén)氏菌SA13之間的相似度達(dá)到100%，3株SA有相同的PFGE型，相似度達(dá)到100%。分析PFGE型相同而且同源性100% 的SA13、SA2、SA15菌株在rep-PCR圖上的分布，發(fā)現(xiàn)3株菌株在rep-PCR樹(shù)狀圖上分布在不同的群中。德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2、SA15在第2群，烏普薩拉沙門(mén)氏菌SA13在第6群，而且在樹(shù)狀圖的空間距離上與前兩株菌相隔較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出不相關(guān)性。這可能是SA13、SA15、SA2對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ有相同的酶切位點(diǎn)，3株SA有相同的PFGE型但有不同的rep-PCR型。分析鼠傷寒沙門(mén)氏菌在PFGE和rep-PCR中的分布，SA4、SA6、SA27、SA36在rep-PCR圖上均分布在第4群，SA4和SA6菌株之間同源性為97.8%，SA27和SA36同源性達(dá)到98.3%，按rep-PCR判斷標(biāo)準(zhǔn)SA4和SA6、SA27和SA36菌株間是不可分辨的關(guān)系，但PFGE結(jié)果，SA4和SA6之間是緊密相關(guān)菌株，SA27和SA36之間是不相關(guān)菌株。相同的現(xiàn)象在阿貢納沙門(mén)氏菌SA16和SA1之間也發(fā)現(xiàn)，兩株菌株在rep-PCR圖上分在第1群，菌株之間相似度98.5%，是不可分辨的菌株，但PFGE結(jié)果兩株菌株的相似度83.3%，相關(guān)性較弱。

圖2 XbaⅠ酶切24株沙門(mén)氏菌PFGE聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrogram constructed by PFGE cluster analysis based on Xba I digestion

3 討 論

rep-PCR已經(jīng)被認(rèn)為是一種細(xì)菌分型的有效方法，rep-PCR已經(jīng)被商業(yè)化成為一個(gè)自動(dòng)化模式，即DiversiLab系統(tǒng)[3]。Healy等[3]在一次對(duì)爆發(fā)和非爆發(fā)相關(guān)的不同血清型腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行的分析中發(fā)現(xiàn)，DiversiLab系統(tǒng)表現(xiàn)出了極其優(yōu)秀的血清型和物種水平鑒別能力。Cangelosi 等[4]用DiversiLab系統(tǒng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌和鳥(niǎo)型分枝桿菌進(jìn)行分型時(shí)，產(chǎn)生其他方法不能分型的分枝桿菌的指紋，本研究用DVL系統(tǒng)對(duì)不同來(lái)源的SA進(jìn)行rep-PCR分型，結(jié)果相同血清型的菌株分布在同一個(gè)群。5株鼠傷寒沙門(mén)氏菌SA4、SA6、SA27、SA31、SA36，4株德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2、SA5、SA29、SA15，烏普沙拉沙門(mén)氏菌SA10、SA11、SA13，阿貢納沙門(mén)氏菌SA1、SA16、SA35，姆班達(dá)卡沙門(mén)氏菌SA22、SA23，均分別分布在同一個(gè)群中。值得一提的是，與德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2、SA15 PFGE型別完全相同的烏普薩拉沙門(mén)氏菌SA13，在rep-PCR樹(shù)狀圖上并非與上述兩株菌株分在一個(gè)群，而是與相同血清型的SA10、SA11分在同一個(gè)群。DVL對(duì)SA種群分析時(shí)，是基于分類(lèi)群之間的親緣關(guān)系進(jìn)行分離，在SA種群的分類(lèi)方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力。

rep-PCR與PFGE分型結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在rep-PCR樹(shù)狀圖中分在同一個(gè)群中的相同血清型SA在PFGE圖譜上并非分在同一個(gè)群，而且樹(shù)狀圖中相隔較遠(yuǎn)、相似性較低。在rep-PCR圖譜判斷標(biāo)準(zhǔn)上，DVL的廠家建議菌株之間相似性大于97%、沒(méi)有條帶的差異，判斷為不可辨別的菌株；相似性大于95%、有1～2條不同的條帶，判斷為相似菌株；相似性小于95%、有多條不同的條帶，則判斷為不同菌株(DVL的rep-PCR圖譜不會(huì)給出100%的相似性)。曲燕燕等[5]按上述判斷標(biāo)準(zhǔn)用DVL對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子分型，Healy等[6]也用上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行分群。本研究rep-PCR圖譜中分在同一群中的相同血清型SA之間相似性均在97%以上，按照DVL判斷標(biāo)準(zhǔn)這些菌株之間是不可分辨的。但在PFGE結(jié)果中觀察，只有德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2、SA15是完全相同的菌株外，阿貢納沙門(mén)氏菌SA16和SA1、鼠傷寒沙門(mén)氏菌SA27和SA36、德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌SA2和SA5，在樹(shù)狀圖上相隔較遠(yuǎn)，彼此之間是不相關(guān)的菌株。這一觀察結(jié)果表明，rep-PCR在進(jìn)行SA種群分類(lèi)時(shí)比PFGE更優(yōu)勝，但對(duì)同種菌株的分型分辨率上PFGE更優(yōu)于rep-PCR。在實(shí)驗(yàn)操作方面，DVL是自動(dòng)化的rep-PCR分型系統(tǒng)，提供標(biāo)準(zhǔn)化的試劑和方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能要求沒(méi)有PFGE高[7-8]。在分型時(shí)間上DVL系統(tǒng)可以在4h內(nèi)自動(dòng)化分析13個(gè)樣品，包括獲得聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖等報(bào)告，而PFGE需要3～5d時(shí)間[9]。總之，在細(xì)菌的分型方法中，DVL系統(tǒng)是一種快速、簡(jiǎn)便的分型方法，對(duì)SA的種群分類(lèi)能力和分辨率也比較高，作為SA快速分型和溯源工具具有潛在的實(shí)用性。

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Molecular Typing Evaluation of Salmonella in Diversilab System

XU Long-yan，YUAN Mu-yun，LIN Wen-li，ZHANG Wang，JIAO Hong
(Food Laboratory of Technology Center, Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510623, China)

Objective: To evaluate the typing performance of DiversiLab system (DVL) for Salmonella. Method: A DVL system, which is based on rep-PCR, was used to type 44 Salmonella isolates from exported and imported foods and compared with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The Salmonella isolates were typed by rep-PCR into 22 groups. The same serotypes of Salmonella isolates from different countries and foods were distributed in the same group with a high similarity. The PFGE results obtained for Salmonella isolates assigned to the same group using rep-PCR indicated a low similarity among all other isolates except No. 2 and No. 15. Conclusion: DVL shows better typing ability but lower resolution for Salmonella than PFGE.

Salmonella；DiversiLab system；rep-PCR；PFGE；molecular typing

Q939

A

1002-6630(2012)03-0203-04

2011-03-27

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B0600013)；廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(2009GDK35)

許龍巖(1970—)，男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭吃葱圆≡肿訖z測(cè)。E-mail：xlyooo@sohu.com