何佳易，徐 鑫,*，劉國艷，蔡麗麗，魏曉蕊，滿其琪，盧正竹

(1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127；2.連云港正榮食品添加劑廠，江蘇 連云港 222000)

小黃魚免疫肽制備條件的響應(yīng)面優(yōu)化

何佳易1，徐 鑫1,*，劉國艷1，蔡麗麗1，魏曉蕊1，滿其琪1，盧正竹2

(1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127；2.連云港正榮食品添加劑廠，江蘇 連云港 222000)

優(yōu)化胰蛋白酶(PTN 6.0S)酶解小黃魚制備免疫肽的制備條件。MTT法檢測酶解產(chǎn)物對小鼠脾細(xì)胞的增殖程度，并以脾細(xì)胞增殖指數(shù)(SI)為指標(biāo)，通過單因素試驗及響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件。結(jié)果顯示：在溫度41.66℃、時間18.24h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶與底物的質(zhì)量比(酶底比)3.13‰條件下，模擬得出多肽產(chǎn)物的SI值為0.387。驗證實驗發(fā)現(xiàn)，在溫度42℃、時間18.2h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3‰條件下，SI值為0.369± 0.003，略低于模擬值，所得條件較為理想。

小黃魚；免疫肽；響應(yīng)曲面法；MTT法

小黃魚在我國海域有著廣泛的分布，屬大宗型海洋魚資源，產(chǎn)量高，但開發(fā)利用率較低，主要為罐頭等初級加工類產(chǎn)品，深加工產(chǎn)品規(guī)模與其產(chǎn)量有著巨大的差距，其作為蛋白來源用于制備生物活性肽的研究尚未見報道。

近40年來，免疫肽因具有與內(nèi)源肽相類似的信號傳導(dǎo)作用[1-3]，已成為提高機體免疫力研究領(lǐng)域的熱點[4-6]。由于活性肽段“隱含”在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，目前主要采用酶解技術(shù)進行制備。該方法受酶種類、底物及酶反應(yīng)條件等諸多因素影響[7]，所以，研究并控制酶法制備的工藝條件尤為重要。

胰蛋白酶是酶法制肽的常用酶制劑之一，一定程度上可模擬食物在腸道的消化分解過程，更重要的是，該酶水解多種食源蛋白均能得到不同活性的免疫肽。首例免疫肽(六肽)即由人乳蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解制得[8]；而該酶的專一特性也利于獲得理想的目標(biāo)產(chǎn)物，如酪蛋白酶解產(chǎn)物中的酪蛋白磷酸肽[9]。所以，綜合考慮后，本實驗選取胰蛋白酶(PTN6.0S)為工具酶。

本實驗以脫脂酶解產(chǎn)物的脾細(xì)胞增殖指數(shù)(stimulating index，SI)值為指標(biāo)，經(jīng)單因素試驗及響應(yīng)曲面法，分析并優(yōu)化免疫肽的制備條件。以期對于規(guī)?；阜ㄖ苽涿庖呋钚噪墓に嚄l件的選擇具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃魚(蛋白質(zhì)含量約20%)，購自連云港市連云區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

ICR小鼠，5～6周齡，揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)比較中心。

胰蛋白酶PTN6.0S(1.89×104U/g) 丹麥諾維信公司；RPMI-1640粉末、含谷氨酰胺 美國Gibco公司；D-Hank,s洗液、青霉素、鏈霉素混合液 生工生物工程(上海)有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；ConA、HEPES、MTT、臺盼蘭粉末 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

524型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦公司；RV10 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Ika公司；5804R高速離心機 德國Eppendorf公司；Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Alpha1-2 LD Plus冷凍干燥儀 德國Christ公司；ZHJH-C2112B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Costa公司；Ex-800酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱 德國賀利氏公司；DM2000顯微鏡 德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽樣品制備工藝

清洗小黃魚→去除內(nèi)臟→絞肉成糜→雙蒸水混勻→加酶→恒溫酶解→滅酶(沸水浴，10min)→離心(10000r/min，4℃，15min)→取上清→濃縮→冷凍干燥→凍干粉脫脂→揮干溶劑→脫脂樣品

1.3.2 酶解條件的單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 不同底物質(zhì)量濃度對細(xì)胞增殖活性的影響

將底物質(zhì)量濃度設(shè)為1、2、3、4、5、6、7g/100mL，按酶底比1‰，pH7.0，溫度50℃反應(yīng)8h，測定脾細(xì)胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.2 不同pH值對細(xì)胞增殖活性的影響

將pH值設(shè)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，溫度50℃反應(yīng)8h，測定脾細(xì)胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.3 不同溫度對細(xì)胞增殖活性的影響

將溫度設(shè)為35、40、45、50、55、60、65℃，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0反應(yīng)8h，測定脾細(xì)胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.4 不同酶底比對細(xì)胞增殖活性的影響

將酶底比設(shè)為0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，pH7.0，溫度50℃反應(yīng)8h，測定脾細(xì)胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.2.5 不同時間對細(xì)胞增殖活性的影響

將時間設(shè)為3、8、13、18、23、28、33h，按底物質(zhì)量濃度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0，溫度50℃反應(yīng)，測定脾細(xì)胞經(jīng)樣品作用后的SI值。

1.3.3 酶解工藝條件的響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)為響應(yīng)值，選取溫度、時間、底物質(zhì)量濃度、酶底比為影響因素，進行四因素三水平分析，共29個試驗點，其中5個為中心點。

表1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計表Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 脾細(xì)胞增殖活性測定[10-13]

采用MTT法，并對其進行一定改良后用于實驗。無菌獲取小鼠脾細(xì)胞，活細(xì)胞比例保證在95%以上，調(diào)整濃度至2×106個/mL，在96孔板中設(shè)空白組、對照組和樣品組，3組分別為細(xì)胞溶液、細(xì)胞+ConA溶液、細(xì)胞+ConA+樣品溶液，各組均設(shè)3個平行，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱，終止培養(yǎng)前4h加入適量無菌MTT溶液，繼續(xù)孵育至結(jié)束。取出培養(yǎng)板，充分離心后，棄上清，加入HCl-異丙醇溶液充分溶解結(jié)晶，離心取上清，于490nm波長處測其OD值。細(xì)胞增殖活性以刺激指數(shù)(SI)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗各值均為3個平行數(shù)據(jù)的均值，響應(yīng)曲面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗樣品的細(xì)胞增殖活性

檢測樣品免疫活性時，以ConA組刺激指數(shù)SI為陽性對照，SI值為0.096±0.0038。

2.1.1 不同底物質(zhì)量濃度對細(xì)胞增殖活性的影響

圖1 不同底物質(zhì)量濃度對SI值的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖1可知，底物質(zhì)量濃度在1～4g/100mL時，SI值明顯上升，但4g/100mL時的上升幅度有所減??；當(dāng)質(zhì)量濃度大于4g/100mL時，SI值開始下降。有學(xué)者報道，酶解程度與底物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)[14]，即可被蛋白酶切斷的肽鍵數(shù)目是酶解工藝的主要影響因素。增加底物質(zhì)量濃度，即增加酶的初始敏感肽鍵數(shù)目，延緩了免疫活性肽段的釋放。

2.1.2 不同pH值對細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 不同pH值對SI值的影響Fig.2 Effect of pH on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖2可知，pH6.0～7.0時，SI值上升，pH值繼續(xù)增大，SI值明顯降低。蛋白質(zhì)對pH值的變化較為敏感，可能與pH值影響酶活性部位和底物蛋白的解離有關(guān)，抑制了活性多肽的釋放[15]。林偉峰[7]學(xué)者在可控酶解魚蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值恒定利于提高肽得率，有必要尋找工藝中酶的較適pH值。當(dāng)pH值為7.0時，SI值明顯最大，所以，在響應(yīng)曲面試驗中，pH值將恒定在7.0。另外，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH值對細(xì)胞活力有一定影響[16]，所以，為尋找酶解工藝中更適pH值，今后的實驗中嘗試在冷凍干燥前將酶解液調(diào)至pH7.0，以防對細(xì)胞活力的影響。

2.1.3 不同酶解溫度對細(xì)胞增殖活性的影響

圖3 不同酶解溫度對SI值的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖3可知， 45℃和50℃時，酶解產(chǎn)物具有較強的細(xì)胞增殖活性。40℃時，利于酶的激活，SI值明顯上升。55℃時，SI值有所下降，但根據(jù)諾維信公司提供的產(chǎn)品資料顯示，此溫度為胰蛋白酶(PTN 6.0S)的最適溫度。由此表明，選擇酶解工藝的溫度時，不僅要考慮酶的最適溫度，還要考慮產(chǎn)物活性。

2.1.4 不同酶底比對細(xì)胞增殖活性的影響

圖4 不同酶底比對SI值的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖4可知，酶底比在0.1‰～2‰時，酶解產(chǎn)物的細(xì)胞增殖活性隨酶用量的提高而增強，且增幅明顯；繼續(xù)提高酶用量，SI值下降。在此酶解過程中，氨基氮含量卻隨酶用量的增加而增加(數(shù)據(jù)未給出)，這也提示，敏感肽鍵的減少易使活性多肽被再次分解，從而失去細(xì)胞增殖能力。所以，有待增加酶解程度，驗證這一猜測。

2.1.5 不同酶解時間對細(xì)胞增殖活性的影響

圖5 不同酶解時間對SI值的影響Fig.5 Effect of hydrolysis duration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由圖5可知，在底物質(zhì)量濃度一定的情況下，隨著時間的延長，并未相應(yīng)提高酶解產(chǎn)物的細(xì)胞增殖活性，18h后，SI值明顯下降。由此表明，底物的酶解程度與產(chǎn)物的細(xì)胞增殖活性并未始終呈正相關(guān)，這可能與活性多肽被進一步水解，或多肽與底物蛋白的競爭性抑制[7]有關(guān)。

2.2 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

表2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件的試驗設(shè)計與結(jié)果(χˉ±s,n＝3)Table 2 Experimental design and results of RSM tests(χˉ±s,n＝3)

響應(yīng)曲面法的試驗設(shè)計及響應(yīng)值結(jié)果如表2所示。Design Expert 7.0軟件分析刺激指數(shù)SI回歸模型的顯著性。結(jié)果顯示，模型的F值為7.67，P值為0.0002＜0.05，表明該回歸模型顯著。失擬項的P值達0.9382，說明失擬不顯著，信噪比為9.425＞4，說明此模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得二次多項回歸方程：SI＝ˉ1.96361＋0.074024A＋0.024035B＋0.18378Cˉ 0.012220Dˉ0.000136019ABˉ0.00332551AC＋0.00059305AD＋0.00234502BCˉ0.000115174BDˉ 0.00110592CDˉ0.000641348A2ˉ0.000899122B2ˉ 0.00545785C2ˉ0.0012695D2?；貧w系數(shù)的顯著性分析結(jié)果顯示，一階主效應(yīng)中的A項(P＝0.0096)，交互作用中的AC項(P＝0.0002)、BC項(P＝0.0145)，純二次項中的A2項(P＜0.0001)、B2項(P＜0.0001)、D2項(P＝0.029)均為顯著項，影響了響應(yīng)曲面的彎曲性。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與條件優(yōu)化

圖6 溫度、時間、底物質(zhì)量濃度、酶底比交互影響SI值的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis temperature, duration, substrate mass concentration and enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

模型的響應(yīng)曲面如圖6所示，6組圖直觀反映了各因素間的交互作用。由曲面的彎曲程度和等高線的封閉情況可以看出，圖6a、c、e、f的穩(wěn)定點均落在實驗范圍里，說明最優(yōu)點的位置基本就在此范圍。圖6a所示，溫度一定時，隨著酶解時間的延長，SI值先升高后下降；時間一定時，SI值隨溫度的升高而下降。同樣，分析其余3組圖，SI值的變化趨勢與單因素結(jié)果相符，結(jié)合方程中交互項的顯著性分析，表明溫度與時間、溫度與酶底比、時間與酶底比、底物質(zhì)量濃度與酶底比的交互作用不明顯。

圖6b、d的曲面變化趨勢不完全符合單因素試驗。圖6b顯示，溫度較低時，SI值隨著底物質(zhì)量濃度的增加而上升，溫度較高時，SI值卻隨底物質(zhì)量濃度的增加而下降，同樣，在不同底物質(zhì)量濃度的情況下，SI值隨溫度的變化也不同；圖6d顯示，酶解時間較短時，SI值隨底物質(zhì)量濃度的增加而降低，時間較長時，SI值與底物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，另外，等高線分布顯示，不同底物質(zhì)量濃度情況下，SI值出現(xiàn)極值的時間也不同。由此證明，溫度與底物質(zhì)量濃度、時間與底物質(zhì)量濃度的交互作用明顯，即一方對響應(yīng)值的影響受另一方制約。軟件對試驗的優(yōu)化結(jié)果為：溫度41.66℃、時間18.24h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3.13‰，多肽產(chǎn)物的SI值為0.387。采用優(yōu)化的條件對酶解小黃魚進行重復(fù)性實驗，為方便操作，條件設(shè)為溫度42℃、時間18.2h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶底比3‰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺激指數(shù)SI為0.369±0.003，與模型估計值0.374相比，相對誤差為0.013。

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果表明，小黃魚免疫肽的酶法制備最優(yōu)工藝為底物質(zhì)量濃度6g/100mL、pH7.0、溫度42℃、酶底比3‰、時間18.2h，其中，底物質(zhì)量濃度與溫度、時間的交互作用顯著。此結(jié)論為進一步研究小黃魚免疫肽的制備工藝提供了參考。

本研究探討免疫肽的制備工藝，其實質(zhì)就是酶反應(yīng)條件對產(chǎn)物活性成分的影響。蛋白酶解的機制普遍復(fù)雜，產(chǎn)物成分較多，主要受底物和酶的影響。實驗選用胰蛋白酶，其作用位點少，價格適中，且能酶切獲得免疫活性肽，屬酶解工藝中的實用酶制劑。結(jié)果分析顯示，小黃魚為底物蛋白，底物質(zhì)量濃度仍然是酶反應(yīng)的主要影響因素。這與Guerard等[17]學(xué)者關(guān)于底物與酶反應(yīng)的報道相符，說明底物中的敏感肽鍵及有潛力被切斷的肽鍵是控制酶反應(yīng)進程的主要因素，同時也解釋了不同酶反應(yīng)階段的產(chǎn)物成分差異性，繼而影響多肽產(chǎn)物的免疫活性。結(jié)合其他因素，分析交互作用可知，溫度、時間對底物質(zhì)量濃度控制酶反應(yīng)進程的影響顯著，這可能與酶活力的改變有關(guān)。總之，在酶法制備生物活性多肽的過程中，不再追求高水解度，應(yīng)以獲得目標(biāo)多肽為宗旨，繼而提高酶解效率，實現(xiàn)較好的經(jīng)濟效益。

本實驗在制備多肽過程中，未先對小黃魚進行脫脂，旨在為后期探索蛋白質(zhì)與脂肪的綜合利用做基礎(chǔ)。然而，隨機抽取數(shù)組未脫脂樣品，考察其免疫活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SI值明顯比同等濃度的脫脂樣品小(數(shù)據(jù)未給出)，主要原因是脂肪酸及其氧化產(chǎn)生的自由基抑制細(xì)胞生長。該發(fā)現(xiàn)與潘妹霞[18]、王彩云[19]、夏延平[20]等的報道相符合，以期為相關(guān)方面的研究提供借鑒。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Production of Immune Peptides from Small Yellow Croaker Using Response Surface Methodology

HE Jia-yi1，XU Xin1,*，LIU Guo-yan1，CAI Li-li1，WEI Xiao-rui1，MAN Qi-qi1，LU Zheng-zhu2
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. Lianyungang Zhengrong Food Additive Factory, Lianyungang 222000, China)

Objective: To optimize process conditions for the hydrolysis of small yellow croaker by trypsin (PTN 6.0S) to prepare peptides with high immuno-activity. Methods: the proliferative effect (expressed as stimulation index, SI) of small yellow croaker hydrolysate on mouse spleen cells was assessed by the MTT assay. Based on the index, single-factor experiments followed by response surface analysis were carried out for the optimization of hydrolysis conditions. Results: The optimal hydrolysis conditions for preparing immune peptides were hydrolysis at 41.66 ℃ for 18.24 h at a substrate concentration of 6 g/100 mL and an enzyme-to-substrate mass ratio of 3.13‰. Under these conditions, the predicted SI of small yellow croaker hydrolysate was 0.387. When the temperature, time and substrate concentration were modified as 42 ℃, 18.2 h and 3‰, the actual SI was 0.369± 0.003, which was slightly lower than the predicted value. Thus, appropriate process conditions were achieved.

small yellow croaker；immune peptides；response surface methodology；MTT assay

TS218

A

1002-6630(2012)03-0151-06

2011-05-03

江蘇省科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項目(BN2008207)

何佳易(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品資源開發(fā)與利用。E-mail：yzu.hejiayi@163.com

*通信作者：徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向為功能性食品資源開發(fā)與利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn