伍 玲，秦禮康*

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

發(fā)酵豆制品中高產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶菌株篩選及固態(tài)菌劑制備

伍 玲，秦禮康*

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

為縮短傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品后熟期，基于轉(zhuǎn)氨反應這一主要風味形成途徑，現(xiàn)從貴州各地采集風味良好的豆豉、腐乳等發(fā)酵樣品，經(jīng)稀釋涂布平板法分離得到150株細菌。通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活力測定，從中篩選出WDH-8菌株具有最高酶活力，菌種鑒定后確定其為地衣芽孢桿菌，屬安全益酵菌株，其支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活力達36.53U/mL。為便于生產(chǎn)應用，對該菌株進行固態(tài)菌劑培養(yǎng)基配方實驗，以轉(zhuǎn)氨酶活力為指標，培養(yǎng)基最佳配方為：黃豆粉25g、水料比1:1(V/m)、氯化鈉添加量5%、葡萄糖添加量3%，其酶活力達到37.965U/mL。

大豆發(fā)酵；轉(zhuǎn)氨酶；菌劑；地衣芽孢桿菌

發(fā)酵豆制品因其獨特的風味，成為廣受喜愛的食品之一。它除了含有大豆本身的營養(yǎng)成分如大豆異黃酮外，在發(fā)酵過程中還產(chǎn)生了類黑精等二次活性成分，因此它的營養(yǎng)價值也越來越受到重視[1]，隨著需求量逐漸增加，使得高質(zhì)高產(chǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)工藝成為今后的必然趨勢。然而，傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品多采用傳統(tǒng)生產(chǎn)技術(shù)手段，它必須經(jīng)過一個較長的后發(fā)酵期后才能形成大豆發(fā)酵制品獨特飽滿的風味。例如，傳統(tǒng)腐乳發(fā)酵周期需要經(jīng)過8～12個月，腐乳的色、香、味才能達到國家質(zhì)量標準要求[2]。所以發(fā)酵豆制品當前存在的問題之一就是要通過開發(fā)新工藝，解決后熟期長的主要矛盾[3]。目前，對加快發(fā)酵豆制品后熟方法的研究已取得的成果有：劉會勇等[4]通過調(diào)整溫度、添加增香酵母和復合酶來實現(xiàn)縮短腐乳的發(fā)酵周期；劉超蘭等[5]應用乳酸菌和酵母共培養(yǎng)技術(shù)縮短郫縣豆瓣醬陳釀周期等。而基于氨基酸代謝的研究方法還未見相關(guān)報道。

研究表明，在形成大豆發(fā)酵制品特征風味物質(zhì)的眾多生化途徑中，以蛋白質(zhì)降解及其氨基酸代謝最為關(guān)鍵[6]。因為蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)破裂所引起的質(zhì)構(gòu)改變，有利于滋香味化合物的釋放，降解產(chǎn)生的短肽和游離氨基酸，不僅直接賦予產(chǎn)品滋味[7]，而且還可作為揮發(fā)性化合物的前體，經(jīng)氨基酸水解酶、轉(zhuǎn)氨酶等催化進行次生代謝或者與還原糖進行Maillard反應，形成大量的揮發(fā)性風味物質(zhì)[8-9]。如源于苯丙氨酸(Phe)等芳香族氨基酸(ArAAs)的苯乙醇等；源于亮氨酸(Leu)等支鏈氨基酸(BcAAs)的異戊酸等[10-12]。因此，本研究以氨基酸的代謝為切入點，通過從貴州各地的發(fā)酵豆制品的原始發(fā)酵菌群中篩選出具有較高氨基酸水解酶活性菌株，將其擴大培養(yǎng)后制成菌劑，在傳統(tǒng)的工藝基礎(chǔ)上進行強化發(fā)酵，對加快后熟有一定的意義。

表1 供試菌株來源及編號Table 1 Details of strains tested in this study

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

實驗菌株：于貴州各地采集到的發(fā)酵豆制品中分離到150株細菌實驗室斜面保存，菌株來源及詳情見表1。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：25g玉米粉溶于1000mL水中煮沸后6層紗布過濾，然后按葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L加入過濾后的玉米汁中；發(fā)酵培養(yǎng)基：配方同種子培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器

丙酮酸、5’-磷酸吡哆醛、十六烷基三甲基溴化銨 上海生工生物工程有限公司；L-亮氨酸、丙氨酸、重蒸餾苯酚 北京索萊寶科技有限公司；2,4-二硝基苯肼 天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

TGL20M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；UV-7502 PC紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；HH.B11.420S型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種復壯活化

將所有保存菌株平板劃線，觀察菌落形態(tài)是否一致；再將菌株細胞染色后于油鏡下觀察其形態(tài)特征是否單一。確定菌種為純種沒有污染雜菌后，菌株接種牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基傳代2～3次，恢復其良好的生長能力。

1.3.2 菌株篩選

1.3.2.1 初篩[13]

活化后菌株接種于種子培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中160r/min培養(yǎng)16h。轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，每株菌平行接種3次，于37℃、160r/min培養(yǎng)24h。取10mL培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min冷凍離心20min后收集菌體，將5mL轉(zhuǎn)氨底物溶液加入收集到的菌體中，37℃振蕩反應6h后利用紙層析法檢測丙氨酸，選取3次平行實驗分離斑顏色均較深者為陽性菌株。

1.3.2.2 酶活力檢測

陽性菌株接種發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)37℃、160r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h后，按文獻[13]的方法：取5mL發(fā)酵液加入5mL底物溶液，0.5mL 2%的十六烷基三甲基溴化銨溶液，37℃振蕩反應1h后，加入0.5mL 10%三氯乙酸終止反應。利用紫外分光光度法檢測丙酮酸，根據(jù)丙酮酸的減少量來計算轉(zhuǎn)氨酶的酶活力。在37℃振蕩反應條件下，將每小時每毫升菌液轉(zhuǎn)化丙酮酸的量(μmol)定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.2.3 丙酮酸測定

采用紫外分光光度法[14]測定。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察

篩選得到的目標菌株按文獻[15]方法抹片、革蘭氏染色后在油鏡下觀察其屬于革蘭氏陽性還是陰性，同時觀察細胞形態(tài)。再經(jīng)芽孢染色油鏡觀察是否產(chǎn)芽孢及芽孢生長位置。菌種接牛肉膏蛋白胨瓊脂平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 生理生化鑒定[16]

根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果，按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版對菌株進行相應的生理生化實驗鑒定。

1.4.316 S rDNA提取測序

采用通用引物：正向27F：5＇-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3＇；反向1492R：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR擴增程序為：94℃ 4min；94℃ 50s，60℃ 90s，72℃ 60s，25個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將測序所得的序列在NCBI上進行序列比對，下載相似度98%以上的序列，用MEGA5.05軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹創(chuàng)建分析。

1.5 菌劑的制備

1.5.1 培養(yǎng)基配方單因素試驗

大豆磨成粉狀經(jīng)40目過篩，稱取25g分裝300mL三角瓶。取25g大豆粉，選取水料比(V/m)3:5、1:1、7:5、9:5；葡糖糖添加量分別為5%、10%、15%、20%，氯化鈉添加量分別為5%、10%、15%、20%，進行單因素試驗，滅菌后接種菌株，37℃培養(yǎng)3d。無菌操作將培養(yǎng)物裝入滅菌紙袋內(nèi)，放入40℃烘箱中鼓風干燥(因考慮到溫度過高會殺死細菌，減少活菌數(shù)；同時溫度過低又會延長后期烘干時間，所以選擇40℃為烘干溫度)。干燥3d后培養(yǎng)物中水分已基本蒸發(fā)，能夠研缽磨成粉狀。最后稱取1g培養(yǎng)物按1.3.2.2節(jié)方法檢測酶活力。

1.5.2 正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)水料比、葡糖糖添加量和氯化鈉添加量對菌株產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶酶活力的影響，設(shè)計L9(33)正交試驗，因素水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素水平設(shè)計表Table 2 Factor and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

表3 高轉(zhuǎn)氨酶菌株的來源及酶活力Table 3 Sources and activities of aminotransferase-producing strains

經(jīng)過初篩，從分離到的150株細菌中選出8株產(chǎn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的菌株作為出發(fā)菌株。測定酶活力后，其中8株具有轉(zhuǎn)氨酶活性的菌株詳情見表3。菌株WDH-8酶活力最高，為36.53U/mL。酶活力越高表明菌株本身具有較強的產(chǎn)酶能力，在發(fā)酵過程中催化轉(zhuǎn)氨基反應能力越強，越能加快氨基酸分解為小分子風味物質(zhì)或轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)生風味的氨基酸，因此選取其作為制備大豆制品后熟菌劑的出發(fā)菌株。

2.2 菌株鑒定

經(jīng)過稀釋平板法觀察到菌株菌落乳白色，表面濕潤不光滑，邊緣呈發(fā)射分支狀。經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)后，菌液澄清，表面形成菌膜。油鏡觀察細胞形態(tài)，菌株革蘭氏陽性，細胞呈短桿狀單生，芽孢端生?？沙醪脚卸ň隇檠挎邨U菌。其他生理生化結(jié)果見表4。

表4 生理生化鑒定結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical properties of strain WDH-8

圖1 菌株WDH-8電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of strain WDH-8

對菌株WDH-8的16S rDNA序列進行擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果見圖1，擴增條帶清晰，大小約為1500bp，沒有其他擴增條帶，因此可判定其為菌株WDH-8 16S rDNA的擴增條帶。經(jīng)測序后得知菌株擴增片段大小為1505bp，將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST中現(xiàn)有的數(shù)據(jù)進行序列比對，結(jié)果顯示它與地衣芽孢桿菌的序列相似度達到99%。下載GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性98%以上的序列，利用Clusta W軟件進行多序列比對并進行人工校正，按照鄰接法聚類，經(jīng)自舉法1000次重復進行檢驗，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。在進化樹中，菌株WDH-8同GenBank中的Bacillus licheniformis類聚于同一分支，步長為100，序列同源性為99%。結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化鑒定結(jié)果，將菌株WDH-8鑒定為地衣芽孢桿菌。

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of selected strains

2.3 菌株WDH-8培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 水料比對酶活力的影響

圖3 25g大豆粉加水量對菌株WDH-8產(chǎn)酶酶活力的影響Fig.3 Effect of material-to-water ratio on aminotransferase production

將最高酶活定義為100%，水料比對菌株產(chǎn)酶的影響如圖3所示。當以25g大豆粉為標準發(fā)酵底物，加水量25mL(即水料比為1:1)時，酶活力達到最高，加水量15mL(水料比為3:5)時的酶活力明顯低于最高酶活力，而當加水量大于25mL后，酶活力大小差異未十分明顯。結(jié)合考慮水料比對后期烘干時間有直接的影響(水分越多烘干時間越長)，選擇水分含量適中，且酶活力較高的培養(yǎng)條件，所以將水料比設(shè)在3:5～7:5之間。

2.3.1.2 氯化鈉添加量對酶活力的影響

圖4 氯化鈉添加量對菌株WDH-8產(chǎn)酶酶活力的影響Fig. 4 Effect of sodium chloride concentration on aminotransferase production

由圖4可知，氯化鈉添加量為5%、10%時，根據(jù)感官，其發(fā)酵物顏色呈深棕褐色，醬香味濃郁，且酶活較為接近；此后，隨著氯化鈉添加量的逐漸增加，發(fā)酵物顏色變淺香味變淡，酶活也隨著降低?？赏茢?，過量的氯化鈉對菌株的生長具有抑制作用，所以將氯化鈉添加量設(shè)為3%～8%。

2.3.1.3 葡萄糖添加量對酶活力的影響

圖5 葡萄糖添加量對菌株WDH-8產(chǎn)酶酶活力的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on aminotransferase production

由圖5可知，當葡萄糖添加量為5%時，發(fā)酵物呈棕褐色，醬香味較濃，酶活力較高。之后當葡萄糖添加量逐漸增加，發(fā)酵物顏色變淺、香味變淡且與添加量5%時差異大，酶活力明顯下降，說明葡萄糖添加量過多，菌株生長勢能較弱，所以將葡萄糖添加量設(shè)為1%～5%。

2.3.2 正交試驗結(jié)果分析

由表5可見，影響菌株產(chǎn)酶活的因素主次關(guān)系是氯化鈉添加量＞葡萄糖添加量＞水料比。最佳配方為A2B2C2，即以25g大豆粉為固定底物時，水料比1:1、氯化鈉添加量5%、葡萄糖添加量3%。最后根據(jù)最佳配方配制培養(yǎng)基，進行3組平行驗證實驗，其菌株WDH-8酶活力平均值達到37.965U/mL，較9組試驗組高，證明通過正交試驗得到的最佳配方有效。方差分析結(jié)果見表6。

表5 正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal array design and results

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

3 結(jié)論與討論

3.1 從貴州各地風味較好的發(fā)酵豆制品中篩選出一株支鏈氨基轉(zhuǎn)氨酶活性較高的菌株。經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，可作為發(fā)酵豆制品的強化發(fā)酵菌株。

3.2 對該菌進行固態(tài)菌劑制備的培養(yǎng)基配方研究，確定最佳配方為大豆粉25g、水料比1:1、葡萄糖添加量3%、氯化鈉添加量5%。目前國內(nèi)外對干酪促熟方法的研究較為成熟，其中發(fā)酵劑在奶酪的后熟研究中應用較多，在成熟過程中，發(fā)酵劑的微生物細胞破裂，所含的多種蛋白酶及肽酶便釋放出來，蛋白酶、肽酶可使蛋白質(zhì)分解成長短各異的肽鏈，然后進一步降解成更短的小肽和多種氨基酸，其中的一些小肽和氨基酸是特定風味物質(zhì)的前體，或直接形成了牛奶干酪的風味[17]。所以，本研究利用制備發(fā)酵劑的方法對分離得到的高產(chǎn)氨基酸水解酶菌株進行擴大培養(yǎng)，能夠快速、大量的培養(yǎng)出目的菌株。并且在擴大培養(yǎng)及保存菌種的整個過程中，條件要求低，能夠確保不提高生產(chǎn)成本。同時，首次利用大豆粉作為發(fā)酵豆制品益酵菌株的載體，由于它與發(fā)酵產(chǎn)品的原料基質(zhì)一致，以至于在強化發(fā)酵時添加發(fā)酵劑后，它不會因加入額外成分而影響發(fā)酵產(chǎn)品的風味，對加快發(fā)酵食品后熟周期的研究具有一定的意義。

3.3 由于大豆發(fā)酵食品，發(fā)酵過程中化學反應復雜，產(chǎn)生的氨基酸種類多，本實驗僅作了其中支鏈氨基酸的水解酶菌株研究，而具有其他氨基酸水解酶活性的菌株有待篩選和研究。

[1]秦禮康. 陳窖豆豉粑益酵菌、風味物及黑色物質(zhì)研究[D]. 無錫: 江南大學, 2006.

[2]李娟. 低鹽腐乳的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2008(5): 212-221.

[3]彭湘屏, 盧紅梅. 腐乳研究新進展[J]. 中國調(diào)味品, 2010, 35(2): 31-34. [4]劉會勇, 楊立蘋, 劉瑞欽, 等. 縮短腐乳發(fā)酵周期的研究[J]. 中國調(diào)味品, 2003, 28(1): 13-14.

[5]劉超蘭, 黃著, 彭熙敏, 等. 乳酸菌和酵母共培養(yǎng)技術(shù)縮短郫縣豆瓣醬陳釀期的應用研究[J]. 中國釀造, 2009(3): 105-108.

[6]楊榮華, 林家蓮, 周霄. 醬油豆醬中褐色色素的生理功能[J]. 中國調(diào)味品, 2000, 25(5): 21-22.

[7]闞建全, 陳宗道, 石軼松, 等. 豆豉非透析類黑精抗氧化和抑制亞硝胺合成的研究[J]. 營養(yǎng)學報, 1999, 21(3): 349-352.

[8]李江偉, 冉國俠, 陳新梅. 豆豉溶栓酶的分離純化及其體外溶栓作用[J]. 中國生化藥物雜志, 1999, 20(3): 148-150.

[9]向梅, 楊金樹, 吳思方. 豆豉纖溶酶的研究進展[J]. 武漢工業(yè)學院學報, 2002(4): 23-26.

[10]PRIETO B, FRANCO I, FRESNO J M, et al. Effect of ripening time and type of rennet (farmhouse rennet from kid or commercial calf) on proteolysis during the ripening of León cow milk cheese[J]. Food Chemistry, 2004, 85(3): 389-398.

[11]SOUSA M J, ARDO Y, McSWEENEY P L H. Advances in the study of proteolysis during cheese ripening[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(6): 327-345.

[12]YVON M, RIJNEN L. Cheese flavour formation by amino acid catabolism [J]. International Dairy Journal, 2001, 11(4/7): 185-201.

[13]王晶, 李江華, 房峻, 等. 轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 微生物學通報, 2008, 35(9): 1341-1347.

[14]樓良旺, 高年發(fā). 紫外分光光度法測定丙酮酸[J]. 分析試驗室, 2005 (4): 11-13.

[15]周德慶. 微生物學實驗教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2006: 79-81.

[16]BUCHANAN R, GIBBONS N. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 中國科學院微生物研究所翻譯組. 8版. 北京: 科學出版社, 1984.

[17]黃永, 崔旭海, 褚福娟. 干酪成熟過程發(fā)酵劑的作用及快速成熟的研究進展[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 25(5): 172-176.

Screening and Identification of Aminotransferase-producing Strain from Fermented Soybean Products and Preparation of Its Solid Starter Culture

WU Ling，QIN Li-kang*
(College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to shorten the fermentation period of fermented soybean products, a total of 150 strains were isolated from top-quality fermented foods in Guizhou. Among these strains, strain WDH-8 was found to have the highest branched-chain aminotransferase activity. The strain was identified as Bacillus licheniformis that was a safe prebiotic yeast strain with a branchedchain aminotransferase activity of 36.53 U/mL. In order to facilitate practical applications, the preparation of its solid starter culture was investigated, and the optimal culture medium for achieving the highest branched-chain aminotransferase activity, 37.965 U/mL, was determined to be composed of soybean power 25 g, material-to-water ratio 1:1, sodium chloride 5% and glucose 3%.

soybean fermenting；aminotransferase；starter cultures；Bacillus licheniformis

TS214.2

A

1002-6630(2012)03-0105-05

2011-09-21

貴州省科學技術(shù)基金項目(黔科合J字[2007]2033號)；貴州省科技重大專項

伍玲(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：yaling5050@126.com

*通信作者：秦禮康(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學及營養(yǎng)與安全。E-mail：likangqin@126.com