蔣 晗，Andrea Day

（1中國計量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江，杭州 3100182 英國利茲大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)院，英國，利茲 LS29JT）

表兒茶素和兒茶素是黃烷醇類化合物的兩個單體，是廣泛存在于蔬菜水果、茶葉和紅酒中的多酚類抗氧化物質(zhì)，對阻止動脈粥樣硬化的形成、預(yù)防脂質(zhì)過氧化以及抵抗癌癥和心血管疾病均有一定作用.黃烷醇類化合物主要以苷元的形式存在，在胃酸中相對穩(wěn)定，但當其消化后轉(zhuǎn)移到小腸和肝臟中時，會很快發(fā)生硫酸化、糖基化和甲基化等代謝反應(yīng).此外，大多數(shù)沒有被小腸吸收的黃烷醇類化合物都被大腸桿菌代謝成了酚酸和戊內(nèi)酯的衍生物后被吸收［1－6］.黃烷醇類化合物的吸收通常都很快，一般0.5～4h便達到吸收高峰，其代謝產(chǎn)物可以很快分泌到尿液和膽汁中［7］.根據(jù)Wang等人的實驗證實，在攝入富含黃烷醇類化合物的食物后，血液中黃烷醇類化合物的濃度在1～2.5h內(nèi)達到高峰［8］，同時Schramm等人進一步證實，在這之后，血液中黃烷醇類化合物的濃度不斷下降直至8h左右?guī)缀醪荒軠y得［9］.

巧克力中尤其是黑巧克力富含黃烷醇，其中最多的是表兒茶素，其次是兒茶素.荷蘭科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，人體攝入的兒茶素含量幾乎有20%來自巧克力［10］.而茶葉中也富含表兒茶素和兒茶素.Henning等人認為茶提取物營養(yǎng)片劑既保留了綠茶和紅茶中的有益物質(zhì)，同時又去除了茶葉中的咖啡因等副作用成分［11］.

目前，很多研究都致力于巧克力中多酚類物質(zhì)在人體內(nèi)的生物利用率［3，12］或者茶葉、茶提取物營養(yǎng)片劑中的多酚成分在人體內(nèi)的生物利用率［13－14］，并且有研究發(fā)現(xiàn)不同的食物組合可能會影響多酚類化合物在人體內(nèi)的吸收和分泌.但其中也不乏爭議性結(jié)論，例如Serafini等人認為牛奶蛋白質(zhì)對兒茶素的吸收有抑制作用［15］.而Hollman和Reddy等人則研究發(fā)現(xiàn)牛奶的攝入對黃酮類化合物的吸收幾乎沒有影響［1，16］.至今還沒有茶提取物營養(yǎng)片劑對黑巧克力中的黃烷醇類化合物在人體中吸收利用率的影響的相關(guān)報道.本文以志愿者尿液為分析樣本，以高效液相色譜（HPLC）為主要分析手段，針對綠茶膠囊對黑巧克力中表兒茶素和兒茶素在人體中的吸收利用率所造成的影響展開研究.

1 材料與方法

1.1 材料

Thorntons牌抗氧化漿果黑巧克力（Thorntons Antioxi Choc Berry Boost，批號：L3031），內(nèi)含藍莓和樹莓提取物，購買于英國.綠茶膠囊購買自英國Healthspan，Guernsey公司.

1.2 試驗儀器與試劑

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，型號Agilent 1200，配紫外檢測器），冷凍微量離心機（美國Thermo Electron Corporation公司，型號IEC MicroCL 17），離心濃縮蒸發(fā)儀（英國Genevac公司，型號EZ－2），電子分析天平（瑞士 Mettler公司，型號 AT－261），渦旋振蕩器（美國 Scientific Industries公司，型號Vortex Genie 2），冷凍型臺式大容量高速離心機（德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge 5810R），線性振蕩水?。ㄓ?國Grant儀器（劍橋）有限公司，型號：Aqua 12plus，超聲波清洗器（英國Clifton公司，型號DU－8）.

甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，購自Fisher Scientific公司.醋酸、四氫呋喃、疊氮化鈉為色譜純，購自Sigma－Aldrich公司.丙酮為色譜純，購自Alfa Aesar公司.β－葡萄糖醛酸苷酶Ⅱ提取自羅馬蝸牛（Helix pomatia，粗提取溶液：116712U／mL）為分析純，（－）－表兒茶素為分析純，均購自Sigma－Aldrich公司.（－）－兒茶素購自Extrasynthèse公司.L－抗壞血酸購自Calibio Chem公司.所有試驗用水均為超純水.

1.3 試驗方法

1.3.1 黑巧克力中（－）－兒茶素和（－）－表兒茶素的提取

黑巧克力中（－）－兒茶素和（－）－表兒茶素的提取采用Langer的方法［17］.

1.3.2 綠茶膠囊中（－）－兒茶素和（－）－表兒茶素的含量測定

取一顆綠茶膠囊，研磨成粉末之后精確稱量.用10mL 25%甲醇溶液（內(nèi)含0.1%抗壞血酸）提取黃酮類化合物，在60℃下水浴15min，超聲5min后冷卻，在35℃下，以3500r／min離心8min，取上清液.再用25%甲醇重復(fù)提取兩次，混合三次提取的上清液（約30mL），取1mL過0.45μm PTFE濾膜，得到HPLC樣品溶液.

1.3.3 給食材及尿樣采集

本試驗經(jīng)英國利茲大學(xué)倫理委員會批準.6名健康受試者（5男1女），年齡（平均值±方差）為（23.7±1.2）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI，單位kg／m2）在19.5～26.6之間，飲食習(xí)慣穩(wěn)定并且無素食主義者，無過敏史，無新陳代謝或腸胃方面的疾病，試驗期間無服用影響代謝的藥物，在簽署知情同意書并體檢合格后納入試驗.受試者隨機分為兩組，受試者在試驗前一天按照所發(fā)放的低黃酮類食物清單進食，于晚8點后禁食12h后（飲用水除外）：第一組受試者于次日晨空腹攝入50g黑巧克力（內(nèi)含152mg表兒茶素和33mg兒茶素），第二組受試者在同一時間空腹攝入50g黑巧克力后立即服用一顆綠茶膠囊（綠茶膠囊含表兒茶素207mg，兒茶素39mg）.在攝入食物前（0h）和攝入食物后（0～1.5，1.5～3，3～5h），總共四個時間段分別收集尿液，分裝在四個容器中（每個容器內(nèi)含0.5g抗壞血酸）.受試者在此期間不得服用除飲用水（每1.5h必須攝入至少200mL飲用水）以外的任何食物.1周后交叉攝入食物，方法和時間點均同前一周期.每位受試者每個時間段的總尿液排放量將被統(tǒng)計.收集到的尿液立即按時間段被分裝入50mL Falcon試管中，每個試管內(nèi)加入0.5mL 10%疊氮化鈉，離心（10min，3000r／min，4℃），去除不可溶物質(zhì)和一些細胞碎片，取上清液于－20℃保存至測定.

1.3.4 尿液樣本處理

參照Ito方法［18］，尿液樣本用自來水解凍后，取1mL轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中，加入0.11mL，1mol／L pH 5.0醋酸－醋酸鈉緩沖液（含1%抗壞血酸）酸化尿液樣本，加入13000U β－葡萄糖醛酸苷酶，在37℃下水浴酶解1h.酶解后，用400μL乙酸乙酯提取尿液中被水解的糖苷配基，渦旋混勻2min，5000r／min離心10min，取上清液.再重復(fù)提取兩次.將三次收集到的上清液（約1.05mL）在離心濃縮蒸發(fā)儀中30℃下干燥1h.用200μL，25%甲醇溶液（含1%抗壞血酸）重溶干燥物質(zhì)，渦旋混勻2min，取1mL通過0.2μmPTFE濾膜制成HPLC樣品溶液.

1.3.5 （－）－表兒茶素和（－）－兒茶素測定液相色譜工作條件

黑巧克力的正相HPLC分析條件［17］：

色譜柱：Phenomenex DevelosilTM二醇基色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，100?），柱溫：35℃，預(yù)柱：Phenomenex Security Guard cartridgeTM氰基柱（4×3.0mm），流動相：A 為乙腈∶醋酸（ACN∶HOAc，98∶2；v∶v），B為甲醇∶水∶醋酸溶液（CH3OH∶H2O∶HOAc，95∶3∶2；v∶v∶v），梯度程序：0～3min，7%B；3～57min，7%B→37.6%B；57～60min，37.6%B→100%B；60～67min，100%B→100%B；67～73min，100%B→7%B；73～83min，7%B→7%B.流速：0.6mL／min；檢測器和檢測波長：熒光檢測器，激發(fā)波長：230nm，發(fā)射波長：321nm；進樣量：5μL.

綠茶膠囊和尿液樣本的反相HPLC分析條件：

色 譜 柱：Waters C18XbridgeTMcolumn（100mm×2.1mm，3.5μm），柱溫：35℃，流動相：A為水：四氫呋喃（THF）∶三氟乙酸（TFA）（H2O∶THF∶TFA，98∶2∶0.1%；v∶v∶v），B為乙腈（ACN）：三氟乙酸（TFA）（ACN∶TFA，99.9∶0.1；v∶v），梯度程序：0min：7%B；0～3.2min，7%→13%B；3.2～7.6min，13%B→15%B；7.6～9.8min，15%B→100%B；9.8～13.6min，100%B→100%B；13.6～15.6min，100%B→7%B；15.6～20.6min，7%B→7%B.流速：0.4mL／min；檢測器和檢測波長：熒光檢測器，激發(fā)波長：230nm，發(fā)射波長：321nm；進樣量：10μL.

1.3.6 標準曲線的制備

巧克力標準曲線：

用萃取劑（丙酮∶水∶醋酸：70∶28∶2）將（－）－表兒茶素標準品粉末和（－）－兒茶素標準品粉末各自配制成2mmol／L標準品溶液.將此標準品溶液用80%的甲醇溶液稀釋，得到0，0.1，1，10，100，500μmol／L標準溶液，通過0.2μm PTFE濾膜制成HPLC樣品溶液.按照1.3.5中黑巧克力的HPLC分析方法檢測，以濃度為橫坐標（μmol／L），以峰面積為縱坐標制備標準曲線.

綠茶膠囊和尿液樣本的標準曲線：

用80%甲醇溶液將（－）－表兒茶素標準品粉末和（－）－兒茶素標準品粉末各自配制成2mmol／L標準品溶液.將此標準品溶液用80%甲醇溶液稀釋，得到0，0.1，1，10，100，500μmol／L標準溶液，通過0.2μm PTFE濾膜制成 HPLC樣品溶液.按照1.3.5中綠茶膠囊和尿液樣本的HPLC分析方法檢測，以添加濃度為橫坐標（μmol／L），以峰面積為縱坐標制備標準曲線.

1.3.7 方法回收率試驗

用25%甲醇溶液（含0.1%抗壞血酸）配制10mmol／L（－）－表兒茶素標準液.用此標準液將1mL任意志愿者尿液空白樣本（0h）配制成含（－ ）－表兒茶素濃度分別為0，10，100 和500μmol／L的尿液樣品.按照1.3.4方法處理尿液樣本，按照1.3.5中綠茶膠囊和尿液樣本的反相HPLC分析方法檢驗（－）－表兒茶素在尿液樣本中的回收率.測得（－）－表兒茶素的回收率在（89.9±4.5）%（n＝3）.

2 結(jié) 果

2.1 表兒茶素和兒茶素HPLC測定方法的標準曲線、線性范圍及檢出限

（－）－表兒茶素和（－）－兒茶素在黑巧克力、綠茶膠囊和尿液樣本中HPLC測定方法的標準曲線和相關(guān)系數(shù)表見表1.（－）－表兒茶素和（－）－兒茶素在0.1～500μmol／L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上.（－）－表兒茶素的檢出限是0.06μmol／L（S／N≥3），定量限為0.20μmol／L（S／N≥10）.（－）－兒茶素的檢出限是0.03μmol／L（S／N≥3），定量限為0.11μmol／L（S／N≥10）.可以滿足本實驗的樣品中這兩種黃烷醇類物質(zhì)的分析.

表1 （一）－表兒茶素和（一）－兒茶素的標準曲線Table 1 Standard curve of（一）－epicatechin and（一）－catechin

2.2 黑巧克力和綠茶膠囊中（一）－表兒茶素和（一）－兒茶素的含量

通過HPLC外標法可知，在黑巧克力的HPLC分析方法中，（－）－表兒茶素的保留時間約為8.7min，（－）－兒茶素的保留時間約為8.9min.通過表1中的標準曲線，可計算得黑巧克力中的（－）－表兒茶素為（303±25）mg／100g（平均值±SD；n＝3），（－）－兒茶素的含量為（66±7）mg／100g（平均值±SD；n＝3）.

同理，在綠茶膠囊的HPLC分析方法中，（－）－表兒茶素的保留時間約為3.2min，（－）－兒茶素的保留時間約為2.0min.通過表1中的標準曲線，可計算得綠茶膠囊中的（－）－表兒茶素為（207±8）mg／100g（平均值±SD；n＝3），（－）－兒茶素的含量為（39±2）mg／100g（平均值±SD；n＝3）.

2.3 表兒茶素、兒茶素和它們的代謝產(chǎn)物在尿液樣本中的定性鑒別

根據(jù)各標準品在相同HPLC條件下的多次實驗保留時間記錄，自由態(tài)兒茶素在尿液樣本中的保留時間約為2.0min，自由態(tài)表兒茶素約為3.1min，3′－甲基兒茶素約為4.3min，3′－甲基表兒茶素約為5.9min，4′－甲基表兒茶素約為7.1min.在本次試驗所收集的尿液樣本中，未發(fā)現(xiàn)磷酸化的表兒茶素和兒茶素.圖1為任意志愿者在兩試驗階段中隨機抽取某一時間段（1.5～3h）尿樣的HPLC分析圖譜.

圖1 尿樣中表兒茶素、兒茶素和它們的甲基化形態(tài)的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatogram of free epicatechin，catechin and their methylated forms in the urine samples

2.4 表兒茶素、兒茶素和它們的代謝產(chǎn)物在尿液樣本中的定量分析

通過表1中尿液樣本的標準曲線的和HPLC對尿液樣本的分析，可以計算出6名志愿者在兩個試驗階段（第一階段：巧克力；第二階段：巧克力＋綠茶膠囊）所收集的尿液樣本中，表兒茶素、兒茶素和它們的代謝產(chǎn)物分別在三個試驗時間段（0～1.5h，1.5～3h，3～5h）的含量，結(jié)果如表2所示.

表2 表兒茶素、兒茶素和它們的代謝產(chǎn)物在尿液中的含量＊Table 2 Quantities of epicatechin，catechin and their metabolites in the urine samples＊ μg

除了第一階段中的3′－甲基兒茶素在第二時間段（1.5～3h）的尿液樣本中才被檢測出，其余尿液分泌的表兒茶素、兒茶素以及它們的代謝產(chǎn)物均在第一時間段（0～1.5h）檢出.實驗發(fā)現(xiàn)，雖然第二階段（巧克力＋綠茶膠囊）所攝入的表兒茶素和兒茶素含量均比第一階段（巧克力）多，但第一階段尿液分泌的表兒茶素、兒茶素以及它們的代謝產(chǎn)物含量均高于第二階段.除此之外，經(jīng)過β－葡萄糖醛酸苷酶的酶解，大部分糖基化的表兒茶素和兒茶素成為自由形態(tài).甲基化的代謝產(chǎn)物中3′－甲基表兒茶素含量較高，3′－甲基兒茶素含量很低.未發(fā)現(xiàn)任何磷酸化代謝產(chǎn)物.

實驗也分析了六位志愿者在不同階段的尿樣中表兒茶素和兒茶素的含量（以表兒茶素或兒茶素的自由形態(tài)和它的甲基化形態(tài)的總量計），如圖2和圖3.從圖2和圖3可知，6位志愿者的尿液空白樣本（0h）中均無表兒茶素或兒茶素成分，且每個階段志愿者間的個體吸收差異較大（p＜0.05）.在6位志愿者中，表兒茶素和兒茶素在尿液分泌中的最高含量均出現(xiàn)在第三時間段（3～5h），這說明可能在5h內(nèi)，兩者在尿液中的分泌過程仍未完全結(jié)束.

圖2 6位志愿者分別在第一階段和第二階段的不同時間段尿樣中表兒茶素的含量Figure 3 Urinary total epicatechin of 3time periods for all 6subjects during phase 1and phase 2study

圖3 6位志愿者分別在第一階段和第二階段的不同時間段尿樣中兒茶素的含量Figure 4 Urinary total catechin of 3time periods for all 6subjects during phase 1and phase 2study

2.5 表兒茶素和兒茶素在人體中的生物利用率

按如下公式計算表兒茶素或兒茶素在人體內(nèi)的生物利用率：

六名志愿者在不同階段中表兒茶素和兒茶素的生物利用率如表3所示.由表3可知，盡管第二階段攝入的表兒茶素和兒茶素總量高于第一階段，但第一階段的表兒茶素和兒茶素在尿液中的回收率均大于第二階段.另外，表兒茶素在兩個試驗階段中的生物利用率均大于兒茶素（除了1號志愿者在第二階段試驗中，兒茶素和表兒茶素生物利用率相等）.

表3 兩個階段中表兒茶素和兒茶素在尿樣中的回收率Table 3 Excretion recovery of EC and C in urine after chocolate intake with （phase 2）or without（phase 1）agreen tea capsule

3 討 論

本實驗研究了綠茶膠囊對黑巧克力中表兒茶素和兒茶素在人體內(nèi)生物利用率的影響.實驗結(jié)果表明，同時攝入黑巧克力和綠茶膠囊與單獨攝入黑巧克力相比，可能會導(dǎo)致人體對表兒茶素和兒茶素的生物利用率降低或者吸收時間的推遲.原因可能是綠茶膠囊中的某些成分和巧克力中的成分相互作用，阻止或延遲了表兒茶素和兒茶素的吸收.Silberberg等人曾在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮和兒茶素在消化水平上存在競爭，導(dǎo)致槲皮黃酮在腸內(nèi)的吸收減少并可能導(dǎo)致兒茶素吸收的延遲［19］.這個情況和本次試驗第二階段較類似，但其為動物性試驗，攝入的多酚類化合物含量也比較高.確切原因需進一步實驗分析.

另外，雖然表兒茶素和兒茶素很快能經(jīng)尿液分泌，但從本次結(jié)果看出，兩者5h內(nèi)在尿液中的分泌過程并未完全結(jié)束.今后試驗可考慮將時間延長至8h，但這對志愿者的耐餓能力要求較高.

其次，本次試驗所采用的HPLC分析方法不能夠鑒別（＋）－兒茶素和（－）－兒茶素等旋光異構(gòu)體.除此之外，有一些沒有經(jīng)尿液分泌的表兒茶素和兒茶素被腸道微生物降解成了小分子的酚酸，本次試驗無法檢測到.這兩個原因可能會導(dǎo)致表兒茶素和兒茶素的生物利用率被低估.

Cao等人發(fā)現(xiàn)在相同條件下同時測定大豆異黃酮在體內(nèi)的濃度，該成分在血漿中的濃度有時并不能和尿液中的濃度很好地吻合［20］.所以進一步的試驗需結(jié)合測定血漿樣品中兒茶素和表兒茶素及其代謝產(chǎn)物的濃度，以更好地確認試驗結(jié)果.

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