萬紅平，付通超，劉文濤，陳正禮

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川雅安 625014）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）分為1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，其中2型糖尿病主要是由于胰島素抵抗或胰島素分泌缺陷引起的［1］。肥胖是引發(fā)2型糖尿病的重要因素，體脂堆積可引起胰島素抵抗，高胰島素血癥，肌肉及其他組織對葡萄糖的利用率降低，并進一步發(fā)展為糖尿?。?］。對肥胖的研究發(fā)現(xiàn)了瘦素（Leptin）［3］，瘦素是一種由肥胖基因編碼的分子質(zhì)量為16ku的多肽激素，主要產(chǎn)生于脂肪組織，在機體攝食、能量代謝平衡和免疫方面具有重要調(diào)節(jié)作用［4－5］。瘦素具有廣泛的生物效應(yīng)，研究表明，瘦素能與胰島素共同作用調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起食欲下降、能量消耗增加［6］。

因此，猜測瘦素可能與糖尿病存在一定的關(guān)系。本研究意在用免疫組織化學的方法，檢測瘦素在2型糖尿病獼猴消化器官組織中的表達，探究瘦素與獼猴2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。另外，本研究以與人類近親的獼猴作為研究對象使試驗數(shù)據(jù)更具有參考價值，為探討瘦素在2型糖尿病患者機體中的作用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 3只患2型糖尿病的成年獼猴川西亞種，3只健康成年獼猴川西亞種，由四川農(nóng)業(yè)大學實驗動物工程技術(shù)中心、國家實驗用獼猴種源基地提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 一抗：兔抗山羊Leptin多克隆抗體，稀釋比例為1∶200；二抗：生物素標記山羊抗兔SABC免疫組化試劑盒（均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；10%福爾馬林、各濃度梯度酒精、二甲苯、石蠟和 PBS（pH 7.4）；LEICA RM2315切片機，Nikon50i2BF熒光生物數(shù)碼顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作 對2組獼猴進行解剖，取出所需胰腺、肝臟、胃和腸道組織，將組織適當修整，投入固定液福爾馬林液中進行固定。固定后，將所取組織流水沖洗數(shù)小時到24h，以去除多余固定液。組織塊經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋、切片。

1.2.2 免疫組織化學染色 切片脫蠟后，按照SABC免疫組織化學染色試劑盒及DAB顯色試劑盒說明書進行免疫組織化學染色。一抗為兔抗山羊leptin多克隆抗體，稀釋比例為1∶200；二抗為生物素標記山羊抗兔SABC免疫組化試劑盒。顯色后蒸餾水洗滌，常規(guī)脫水，透明并封片，鏡檢并拍照。

1.2.3 對照試驗 用PBS代替一抗作為陰性對照，以脂肪組織作為陽性對照。

1.2.4 結(jié)果判斷 瘦素陽性結(jié)果：細胞結(jié)構(gòu)清晰，棕黃色顆粒定位良好，染色明顯高于背景，細胞核或細胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；陰性對照組應(yīng)為背景色淺或無色，無明顯棕黃色顆粒。

1.2.5 光密度值測定及統(tǒng)計學分析 對切片進行觀察，并于100倍、200倍和400倍鏡下拍照若干張，每種組織于相同倍數(shù)下隨機抽取3張，用捷達801形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)軟件進行光密度值測量。用SPSS13.0生物統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以平均值±標準差表示，兩組間比較用t檢驗。P＜0.01或P＜0.05均為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色

2型糖尿病獼猴的胃體部固有層的壁細胞黏膜層增厚，黏膜上皮表層呈棕黃色陽性反應(yīng)；胰腺的胰島可見大小不等的棕黃色顆粒；肝星型細胞中可見環(huán)狀分布的棕黃色顆粒，呈Leptin免疫陽性反應(yīng)；腸道以結(jié)腸和空腸于固有層的柱狀細胞及黏膜上皮細胞表層陽性反應(yīng)最為明顯，其他腸段陽性細胞相對分布少且陽性較弱，2型糖尿病獼猴組織陽性表達相對于對照組明顯（圖1～圖5）。

圖1 2型糖尿病獼猴結(jié)腸中黏膜上皮表層可見棕黃色層，呈Leptin免疫陽性反應(yīng)，SABC染色（400×）Fig.1 Tan layer in colon submucosa of Macaca mulatta with type 2 diabetes shows leptin positive immunoreactivity，SABC（400×）

圖3 2型糖尿病獼猴的胃壁細胞黏膜層增厚，呈Leptin免疫陽性反應(yīng)，SABC染色（100×）Fig.3 The incrassation of mucosa in parietal cell of Macaca mulatta with type 2diabetes shows leptin positive immunoreactivity，SABC（100×）

圖5 2型糖尿病獼猴的肝臟可見環(huán)狀分布的棕黃色顆粒，SABC染色 （200×）Fig.5 Circular distribution of tan particles in liver of Macaca mulatta with type 2shows leptin positive immunoreactivity，SABC（200×）

圖2 2型糖尿病獼猴的空腸絨毛上皮呈Leptin免疫陽性反應(yīng)，SABC染色 （100×）Fig.2 The chorioepithelium of jejunum of Macaca mulatta shows leptin positive immunoreactivity，SABC（100×）

圖4 2型糖尿病獼猴的胰腺可見棕黃色顆粒，呈Leptin免疫陽性反應(yīng)，SABC染色（100×）Fig.4 Tan particles in pancreas of Macaca mulatta with type 2 diabetes shows leptin positive immunoreactivity，SABC（100×）

2.2 糖尿病獼猴組織與健康獼猴組織平均吸光度值統(tǒng)計結(jié)果

糖尿病獼猴組織與健康獼猴組織平均吸光度值統(tǒng)計結(jié)果見表1。表1顯示，與對照組相比，2型糖尿病獼猴組織瘦素水平在胰腺、肝臟、胃、空腸、結(jié)腸差異極顯著 （P＜0.01）；十二指腸、回腸、盲腸差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

近年來，基于瘦素在機體攝食、血糖和脂類代謝、肥胖發(fā)生等方面的重要調(diào)節(jié)作用，使人們對糖尿病和肥胖癥有了新的認識。而2型糖尿病的主要病理生理基礎(chǔ)是胰島素抵抗（Insulin resistance，IR），IR是指胰島素作用的靶器官，如肝臟、肌肉組織等對一定量的胰島素的生物學反應(yīng)低于正常水平［7－8］。瘦素與胰島素抵抗關(guān)系密切，在胰島素抵抗中起一定作用［9］。目前有研究表明，位于下丘腦的瘦素受體與瘦素結(jié)合后，使下丘腦弓狀核分泌神經(jīng)肽Y減少，從而降低胰島素水平，并減少攝食，增加能量消耗，改善胰島素抵抗；而位于胰島B細胞上的瘦素受體與瘦素結(jié)合后，則能抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌，對糖耐量異常和糖尿病病人的血胰島素水平、血糖均有一定影響［10－11］。本研究中，2型糖尿病獼猴消化系統(tǒng)組織中瘦素表達水平明顯高于對照組，且與對照組相比，胰腺、肝臟、胃、空腸和結(jié)腸表現(xiàn)為差異極顯著；十二指腸、回腸和盲腸表現(xiàn)為差異顯著。說明2型糖尿病獼猴體內(nèi)存在較高的瘦素表達，且不同組織表達量存在差異性。瘦素的表達與獼猴2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有明顯的相關(guān)性，進一步說明了瘦素的分泌是2型糖尿病的重要表征之一，提示瘦素的研究可能為2型糖尿病的進一步研究及治療提供新的思路。

表1 病變組與對照組平均吸光度值統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Testing results of average optical densities between type 2diabetes mellitus group and normal group

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