孫彩琴，劉建枝，黃 磊，羅布頓珠，汪月鳳，劉志杰，羅建勛，殷 宏＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000）

無漿體病（Anaplasmosis）（舊稱邊蟲?。┦墙?jīng)蜱傳播的細(xì)胞內(nèi)專性寄生的一類立克次體目無漿體科無漿體屬的無漿體引起的疾?。?］。該病多發(fā)于牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物，菌體寄生于宿主紅細(xì)胞內(nèi)。病程常呈慢性經(jīng)過，臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和漸進(jìn)性消瘦，急性發(fā)病時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物死亡［2］。目前研究最多的動(dòng)物無漿體有3種，即邊緣無漿體（A.marginale）、中央無漿體 （A.centrale）和羊無漿體（A.ovis）。硬蜱是羊無漿體的主要傳播媒介。我國(guó)西北廣大養(yǎng)羊區(qū)羊無漿體的媒介蜱有3種，它們分別為分布在甘肅和寧夏的草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、內(nèi)蒙古西部地區(qū)的亞東璃眼蜱（Hyalommaasiaticum）和短小扇頭蜱 （Rhipicephaluspurmilio），并證明這3種蜱對(duì)羊無漿體的傳播方式都是間歇性吸血傳播。

無漿體的常規(guī)診斷主要是根據(jù)流行史、臨床癥狀、尸體剖檢和血涂片檢查等進(jìn)行綜合診斷。但常規(guī)檢測(cè)難以發(fā)現(xiàn)早期感染，亦不利于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，分子生物學(xué)診斷方法可彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法的不足。分子生物學(xué)診斷方法主要有核酸探針檢測(cè)法、反向線狀印跡雜交技術(shù)（RLB）［3］和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR技術(shù)已被用在大多數(shù)無漿體病原的檢測(cè)上，由于邊緣無漿體、中央無漿體和羊無漿體的MSP5基因和MSP2基因之間的同源性較高，已成為屬特異性PCR檢測(cè)的主要目標(biāo)基因。另外，主要抗原蛋白1（MAP1）和16SrRNA基因也是常用的靶基因。16SrRNA基因是目前常用于細(xì)菌分類鑒定的基因之一，尤其適用于不能培養(yǎng)的病原菌的分類鑒定，該基因在無漿體病原分類鑒別上已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用。

無漿體病多發(fā)于夏秋季，與媒介蜱的活動(dòng)季節(jié)相一致，在3月～6月出現(xiàn)，8月～10月達(dá)高峰，11月尚有個(gè)別病例。銀盾革蜱（DermacentorniveusNeumann，1987）與西藏革蜱（D.everesitianusHirst，1926）是我國(guó)西部省區(qū)常見的蜱種。它們都是高原蜱種，2月到6月是其活動(dòng)高峰期，D.niveus分布于陜西、青海、甘肅、新疆和西藏，D.everesitianus分布于高原灌叢草原，多在海拔4 000m以上。當(dāng)雄（藏語意為“挑選的草場(chǎng)”），位于西藏自治區(qū)中部，可利用草場(chǎng)面積70萬hm2，該縣是個(gè)牧業(yè)生產(chǎn)縣，其中綿羊22.46萬只，占家畜存欄總數(shù)的42.55%。無漿體病的分布對(duì)當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成了潛在的威脅。本研究采用無漿體屬特異性引物從蜱的全基因組中擴(kuò)增16SrRNA基因的部分片段，對(duì)西藏當(dāng)雄地區(qū)蜱無漿體感染率及種類進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進(jìn)化分析，為該地?zé)o漿體病的診斷和防控提供流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2011年5月份從西藏當(dāng)雄縣三個(gè)地區(qū)即當(dāng)雄縣城地區(qū)、烏瑪鄉(xiāng)和龍仁鄉(xiāng)的綿羊身上采集未叮咬的成蜱樣品。樣品保存在750mL／L的乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室后由專業(yè)人員根據(jù)形態(tài)學(xué)對(duì)蜱進(jìn)行種類和性別鑒定。

1.1.2 主要儀器和試劑 基因組提取試劑盒：QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）；PCR 儀：My cycler thermal cycler （BIORAD），DNA Engine peltier Thermal Cycler（BIORAD）；DYY－Ⅱ型電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；JS－680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司生產(chǎn)；DNA凝膠回收試劑盒，LATaqDNA聚合酶和 dNTP，10×PCR buffer，克隆載體pGEM－T Easy，大腸埃希菌JM109，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 引物 EE1／EE2［3］可擴(kuò)增無漿體16SrRNA基因，具有無漿體屬特異性，預(yù)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為1 430bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：EE1：5′－TCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC－3′；EE2：5′－AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG－3′。

1.2.2 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增 樣品DNA的提取方法參照QIAamp DNA Mini Kit說明書進(jìn)行。首先用雙蒸水潤(rùn)洗10min，置于吸水紙上，晾干后放入1.5mL的Eppendorf管中（每管1只）；每管中加入50μL PBS（pH7.2）緩沖溶液，利用消毒好的剪刀和鑷子將其盡量剪碎；各管中加入180μL ATL溶液，20μL蛋白酶K，渦旋混勻，置于56℃加熱器中3h使得組織充分裂解；短暫離心后，加入200μL AL溶液，脈沖式渦旋15s，70℃孵育10min；短暫離心后，加入200μL無水乙醇，同上進(jìn)行渦旋；將QIAamp層析柱安裝到2mL收集管中，把上一步驟中得到的混合物轉(zhuǎn)入層析柱中，靜置1min后，8 000 r／min離心1min；棄去收集管，將層析柱安裝在新的收集管上，加入500μL AW1溶液，8 000r／min離心1min；換上新的收集管后，加入500μL AW2溶液，14 000r／min離心3min；再高速空離1min，將層析柱安裝在1.5mL Eppendorf管上，加入50 μL AE溶液，室溫孵育5min，8 000r／min離心1 min。隨機(jī)挑選提取的基因組，用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)對(duì)其純度和濃度進(jìn)行測(cè)定，基因組DNA樣品置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物合成后用滅菌雙蒸水將其稀釋成10 μmol／L，PCR反應(yīng)體系為25μL。在PCR反應(yīng)管中加入以下成分：LATaq酶0.25μL；10×LA PCR buffer 2.5μL，dNTP 4μL，EE1 1μL，EE2 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 15.25μL。每組反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照，以蒸餾水代替基因組DNA。PCR反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，12℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物連接、克隆及鑒定 PCR陽性產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，而后進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為10μL，包括純化的產(chǎn)物3μL，pGEM－T Easy載體1μL，連接酶buffer 5μL，T4DNA連接酶1μL，充分混勻后16℃水浴連接過夜。取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG（100 mmol／L）4μL，X－gal（20mg／mL）16μL，混勻后涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)16h～18h。從平板上挑取單個(gè)白色菌落接種于4 mL LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)6h。PCR檢測(cè)為陽性的菌液樣品送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。應(yīng)用DNA Star分子生物學(xué)軟件處理獲得的序列，并在 http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 相似性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析 從NCBI中下載相關(guān)物種的16SrRNA基因序列，將犬埃里克體（Ehrlichiacanis）（EF011111）作為外群，選擇羊無漿體3株，分別是A.ovisisolate Yuzhong［AJ633050］，A.ovisisolate Jingtai［AJ633049］和A.ovisisolate OVI from South Africa［AF414870］；邊緣無漿體4株，分別是A.marginalestrain Veld［AF414873］，A.marginalestrain Florida［AF309867］，A.marginalestrain St.Maries［AY048816］和A.marginalestrain South Idaho［AF309868］；中央無漿體2株，分別為A.centralestrain vaccine from Australia［AF414868］和A.centralestrain Israel vaccine［AF309869］；另外還有A.bovisisolate R7［JN558828］，A.phagocytophilumclone J4－3－6［AY969014］和本研究中測(cè)序獲得的2個(gè)克隆，A.ovisisolate XG34和LYG106，共14條序列。采用Mega Align 4.0數(shù)據(jù)軟件處理序列，用鄰近法（NJ）構(gòu)建16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行多序列的同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 各地區(qū)蜱的分類及無漿體16SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

采集的511份饑餓成蜱，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為2個(gè)種，即西藏革蜱（D.everestianus）和銀盾革蜱（D.niveus）。以提取的蜱基因組DNA為模板，采用無漿體屬16SrRNA基因特異性引物對(duì)EE1／EE2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在1 400bp附近擴(kuò)增出一條特異性的條帶，與預(yù)測(cè)的目的片段大小一致（圖1）。這批樣品中，共檢出陽性樣品34份，總體感染率為6.7%（34／511）（表1）。將部分陽性樣品中的目的片段進(jìn)行回收、連接和克隆，將菌液PCR鑒定為陽性的菌液送出測(cè)序，得知擴(kuò)增產(chǎn)物為1 430bp，BLAST結(jié)果顯示與羊無漿體同源性較高。

2.2 16SrRNA基因序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過PCR方法共檢出陽性樣品34份，但由于其中3個(gè)樣品擴(kuò)增出來的目的產(chǎn)物含量較低，導(dǎo)致連接失敗，最終只獲得31條序列。將這些序列進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)同源性范圍為99.6%～100%。提示我們檢測(cè)到的無漿體是單一種，在NCBI中BLAST分析后，證實(shí)與羊無漿體關(guān)系最近。

圖1 16SrRNA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of the 16SrRNA gene from field samples and control

表1 西藏蜱樣中羊無漿體的感染率情況Table 1 The infection rate of A.ovis in ticks collected from Tibet

再將本試驗(yàn)測(cè)序獲得的2個(gè)克隆序列XG34和LYG106的16SrRNA基因序列與GenBank收錄的A.ovis［AJ633050、AJ633049和 AF414870］，A.marginalestrain Veld［AF414873、AF309867、AY048816和AF309868］，A.centrale［AF414868］和A.centrale［AF309869］，另外還有A.bovis［JN558828］，A.phagocytophilum［AY969014］等序列進(jìn)行同源性分析，顯示本試驗(yàn)獲得的克隆與A.ovis同 源 性 最 高，為 99.7% ～99.8%；與A.marginale和A.centrale的同源性為99.1%～99.4%；與A.bovis和A.phagocytophilum同源性為95.9%、96.2%。

用上述14條16SrRNA基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示XG34和LYG106分離株的16S rRNA基因序列與A.ovis（AJ633049、AJ633050和AF414870）位于同一分支上。A.marginale、A.centrale、A.bovis和A.phagocytophilum分別位于不同的分支上（圖2）。以上數(shù)據(jù)一致表明，本研究中檢測(cè)到的病原是羊無漿體。

3 討論

無漿體病是一類重要的自然疫源性疫病。主要病原有嗜吞噬粒細(xì)胞無漿體（A.phagocytophilum）、邊緣無漿體、中央無漿體、牛無漿體（A.bovis）和 羊無漿體。該病病原的傳播媒介為硬蜱，研究已證實(shí)微小牛蜱（Boophilusmicroplus）、亞東璃眼蜱 （Hyalommaasiaticum）、篦子硬蜱 （Ixodes ricirus）和有紋革蜱 （Dermacentorpictus）可傳播邊緣無漿體，草原革蜱 （D.nuttalli）、銀盾革蜱（D.niveus）、亞東璃眼蜱 （H.asiaticum）和短小扇頭蜱 （Rhipicephaluspurmilio）可傳播羊無漿體［4］，長(zhǎng)角血蜱 （Haemaphysalislongicornis）和巨棘血蜱（H.megaspinosa）可傳播牛無漿體［5－7］，全溝硬蜱（Ixodespersulcatus）可傳播嗜吞噬細(xì)胞無漿體［8］。羊無漿體廣泛分布于世界各地，盡管致病性不是很強(qiáng)，但會(huì)影響?zhàn)B羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究應(yīng)用常規(guī)PCR方法對(duì)西藏當(dāng)雄地區(qū)的蜱樣進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)呈單一無漿體，即羊無漿體感染，感染率為6.7%。西藏革蜱和銀盾革蜱的感染率分別為6.1%和6.7%，不同蜱種的感染率差異不顯著。從西藏革蜱和銀盾革蜱的基因組中分別擴(kuò)增到了羊無漿體16SrRNA基因，證明這兩種蜱是該地區(qū)羊無漿體病的潛在傳播媒介。對(duì)不同地區(qū)蜱感染無漿體結(jié)果分析顯示，不同地區(qū)感染率有較大區(qū)別，其中烏瑪鄉(xiāng)最高，為20.6%（14／68），當(dāng)雄縣城地區(qū)與龍仁鄉(xiāng)樣品的陽性率較低，分別為5.7%（5／88）和4.2%（15／355）。已知羊無漿體對(duì)山羊和綿羊危害較為嚴(yán)重，而當(dāng)雄縣局部地區(qū)蜱綿羊無漿體感染率較高應(yīng)引起當(dāng)?shù)孬F醫(yī)工作者的重視。

圖2 利用16SrRNA基因序列構(gòu)建的無漿體系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Anaplasmaspecies constructed using partial 16SrRNA sequences

無漿體傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有鏡檢和體外培養(yǎng)，但體外培養(yǎng)不易進(jìn)行，盡管近年來邊緣無漿體的體外培養(yǎng)取得了一定的進(jìn)展，但至今尚未有羊無漿體體外培養(yǎng)的報(bào)道。鏡檢雖然比較省時(shí)省力，易于操作，但對(duì)于一些泰勒蟲和巴貝斯蟲混合感染病例，鏡檢較難有效地對(duì)病原進(jìn)行區(qū)分。由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)，缺乏合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，也較難用顯微鏡鏡檢地方法準(zhǔn)確的區(qū)分病原，把16SrRNA基因引入到了羊無漿體的分類學(xué)研究之中能較好的彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類學(xué)的缺陷。有研究以16SrRNA基因序列合成通用引物，對(duì)邊緣無漿體進(jìn)行了擴(kuò)增，并提出了用這種方法對(duì)邊緣無漿體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究的可能性，為無漿體病的分子分類學(xué)研究提供了依據(jù)。本試驗(yàn)就是基于這種方法，擴(kuò)增出了大小為1 430bp的特異性片段，將測(cè)序獲得的2個(gè)克隆XG34和LYG106的16SrRNA基因序列作為代表序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的11株菌株的16SrRNA基因序列進(jìn)行同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。從進(jìn)化樹上看出，從西藏地區(qū)檢測(cè)到的羊無漿體與國(guó)內(nèi)報(bào)道的2株羊無漿體和南非分離到的A.ovisisolate OVI分到了一個(gè)大的分支上，并且可區(qū)分邊緣無漿體和中央無漿體，這些結(jié)果不但再次證明了該分類標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用價(jià)值和意義，也證明了16SrRNA在無漿體種內(nèi)的高度保守性。這與周作勇［2］獲得的結(jié)果一致。

該病呈世界性流行，已報(bào)道的國(guó)家有伊朗、敘利亞、伊拉克、哈薩克斯坦、土庫曼、烏茲別克斯坦和美國(guó)等。在我國(guó)新疆和布克塞耳蒙古自治縣也發(fā)現(xiàn)有綿羊無漿體病。應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和病原檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)甘肅綿羊無漿體病的分布進(jìn)行了調(diào)查，在陜西、甘肅、寧夏和青海四?。▍^(qū)）23個(gè)縣的綿羊和山羊中發(fā)現(xiàn)綿羊無漿體病。近年來河南、山東、四川和廣東發(fā)現(xiàn)有該病，給疫區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成了威脅［9－11］。本研究豐富了我國(guó)綿羊無漿體病的流行病學(xué)資料，提示西藏地區(qū)也有此病的分布。但本次采樣地點(diǎn)集中在當(dāng)雄縣，不能代表整個(gè)西藏地區(qū)，在西藏地區(qū)開展更大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查是在該地區(qū)開展本病研究的當(dāng)務(wù)之急。

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