李 結(jié)，王培園，張 萍，劉遠(yuǎn)佳，郭建超，孟祥龍，李國清

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

賈第鞭毛蟲（Giardiasp.）簡稱賈第蟲，是一種呈全球性分布的重要人獸共患性寄生原蟲，能廣泛寄生于人、哺乳動物、鳥類、兩棲類及嚙齒類動物的腸道，導(dǎo)致腹瀉和消化不良等癥狀，諸多臨床病例和流行病學(xué)資料均已證明賈第蟲病是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的原蟲?。?－3］。賈第蟲病是一種水源性傳播的疾病，常年流行但多見于夏季。飲用水被污染是造成該病流行和暴發(fā)的重要因素。本病已被列為全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一［4］。近年來研究顯示，賈第蟲合并人免疫缺陷病毒（HIV）感染，并在同性戀者中流行的報道不斷增多［5］。

近年來，寵物犬賈第蟲感染也較普遍，且可流行和傳播人獸共患的賈第蟲基因型，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。因此，對賈第蟲進行研究就顯得尤為重要。賈第蟲延長因子（elongation factor 1alpha，EF1α）基因是蛋白質(zhì)合成過程中肽鏈延伸所需的蛋白因子的基因，進化速率相對較慢，因此常被用于賈第蟲的基因型鑒定。本試驗以廣州犬糞便中發(fā)現(xiàn)的賈第蟲為研究對象，針對其EF1α基因設(shè)計引物，進行PCR擴增、克隆和測序，通過序列分析比對，對本次分離的犬源賈第蟲進行了分子鑒定，為賈第蟲的分子遺傳學(xué)和分子診斷學(xué)研究及賈第蟲病的防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便樣品 犬糞便樣品采自廣東廣州某寵物醫(yī)院。每個糞樣取10g～15g，加5倍自來水?dāng)噭颍?0目銅篩過濾，將濾液以2 500r／min離心10min，棄上清，按糞便量的5倍體積加入330g／L硫酸鋅漂浮液，然后用小鐵絲環(huán)蘸取漂浮液表層涂片鏡檢。將形態(tài)學(xué)鑒定為陽性的糞便樣品保存至4℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒（Stool DNA Kit）、WizardTM DNA Clean－Up System試劑盒、pGEM －T Easy Vector，均為Promega公司產(chǎn)品；dNTPs（2.5mmol／L）、ExTaqDNA 聚合酶、6×Loading buffer、DNA Marker DL 2 000、IPTG和X－gal均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merk公司產(chǎn)品；Biometra PCR儀器為德國Biometra公司產(chǎn)品；Bio－RAD電泳系統(tǒng)為美國Bio－RAD公司產(chǎn)品；凝膠圖像分析系統(tǒng)為英國Uvitec公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物設(shè)計 將純化后的包囊用Promega公司的糞便提取試劑盒（Stool DNA Kit）抽提賈第蟲全基因組DNA，并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮虾ＳⅡE生物技術(shù)有限公司合成，上游引物 EF：5′－CTGGTCACCGCGACTTCA－3′，下游 引 物 ER：5′－ACTCCTCGGCCTTCTTCC－3′，預(yù)期擴增片段為288bp。

1.2.2 PCR擴增目的片段 PCR擴增體系為25μL：EF／ER引物各0.25μL，10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，MgCl23μL，Ex－Taq酶0.25μL，無菌水15μL，DNA樣品2μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，循環(huán)35次；最后72℃5min。同時設(shè)置陰性對照組，只加入與樣品DNA量相同的無菌雙蒸水。PCR產(chǎn)物在以0.5×TBE為電泳液的10g／L瓊脂糖凝膠中電泳，0.5mg／L溴化乙錠（EB）染色，紫外分析儀下觀察，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及篩選 用DNA膠回收試劑盒對擴增片段進行純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM－T Easy載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM 109中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含氨芐青霉素和

圖1 犬源賈第蟲EF1α基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1PCR amplification result of EF1αgene from Giardia lamblia

2.3序列測定及分析

犬源賈第蟲EF1α基因PCR擴增序列長為288bp，其序列核苷酸組成（圖3）。將測序結(jié)果在NCBI中進行Blast比對，然后從GenBank中下載IPTG的LB平板上，過夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，進行菌液PCR鑒定，篩選出陽性克隆。

圖3 犬源賈第蟲EF1α基因的序列Fig.3 Sequence of the dog－derived Giardia EF1αgene

1.2.4 序列測定與分析 挑選樣本中鑒定為陽性的菌液送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序，Blast比對測序結(jié)果，然后從GenBank下載相關(guān)序列用DNA Star軟件進行序列分析與比較，并構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

PCR擴增出的片段為288bp左右，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1）。

2.2克隆、轉(zhuǎn)化及菌液PCR

用純化回收試劑盒回收樣品的PCR產(chǎn)物并將之克隆到pGEM－T Easy載體中，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM 109，然后進行菌液PCR鑒定，得到的片段為288bp左右，與預(yù)期目的條帶大小一致（圖2）。相關(guān)序列，采用DNA Star軟件建立系統(tǒng)進化樹（圖4）。結(jié)果表明本次分離的廣州犬源賈第蟲基因型為D型。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2dentification of recombinant plasmids by PCR

圖4 犬源賈第蟲EF1α基因的系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree on EF1αgene of the dog－derived Giardia

3 討論

藍(lán)氏賈第蟲（Giardialamblia）是一種呈世界性分布的人獸共感染的寄生性原蟲。據(jù)WHO估計，賈第蟲全世界人口的感染率約為30%，在我國，各地區(qū)感染率不同，約在1%～20%左右（平均約2.54%）［6］。在美國，每年大約有2.8×106人感染賈第蟲，因此賈第蟲被稱為“頭號腸道寄生蟲”［7］。近年來，寵物犬深受人們喜愛，但寵物犬能感染人獸共患賈第蟲基因型，這可能會通過多種途徑傳染給人，對人類健康構(gòu)成潛在威脅［8］。因此，對寵物犬源賈第蟲進行分子鑒定及準(zhǔn)確分型具有重要的公共衛(wèi)生意義。

藍(lán)氏賈第蟲是一個復(fù)雜的集合體，至少可分為7個有效集聚體或基因型（A～G）。其中只有A和B型是人獸共患的基因型，可感染包括人在內(nèi)的大部分哺乳動物。A型主要有AⅠ和AⅡ，AⅠ為人獸共患型，AⅡ只感染動物；B型是人獸共患型且宿主范圍較廣；C和D型主要感染犬；E型可感染反芻動物；F和G型可分別感染貓和家鼠［9］。分子生物學(xué)技術(shù)是對賈第蟲進行分子鑒定及基因型鑒定的重要手段，目前，常用于賈第蟲基因型鑒定的分子標(biāo)記主要有小亞基核糖體RNA基因（SSU－rRNA）、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因（tpi）、谷氨酸脫氫酶基因（gdh）、β－賈第素基因（bg）和α－延伸因子1基因（ef1－α）等［10］。肖淑敏等［11］針對16SrRNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS－rRNA基因序列設(shè)計引物，首次對我國分離的牛源賈第蟲進行了基因型鑒定，結(jié)果為E型。朱海波等［12］用16SrRNA基因和gdh基因作為分子標(biāo)記，對廣東首株犬源賈第蟲進行了基因型鑒定，16S－rRNA基因的序列分析結(jié)果顯示該犬源賈第蟲的基因型為A型，對gdh基因序列進一步分析顯示該基因型為AⅠ亞型，屬于人獸共患基因型。Minvielle M C等［13］利用tpi基因設(shè)計引物，對采自阿根廷的60份兒童糞樣進行基因型鑒定，結(jié)果顯示43份為陽性，其中3份為AⅡ型，40份為B型。Caccio S M等［14］用bg基因鑒定出人源賈第蟲的基因型為AⅠ、AⅡ、BⅠ和BⅡ和BⅢ。Lalle M等［15］針對bg基因設(shè)計引物對意大利的含有賈第蟲包囊的37份人糞樣和25份狗糞樣進行巢式PCR擴增，結(jié)果顯示，人糞樣中只檢測到A型和B型。狗糞樣中6份為A型，其余均為C型和D型，

本研究根據(jù)GenBank中登錄的賈第蟲EF1α基因序列設(shè)計引物，首次對我國廣州犬糞中分離的賈第蟲EF1α基因進行了擴增、克隆和測序。結(jié)果表明，本次分離的犬源賈第蟲基因型為藍(lán)氏賈第蟲D型，且EF1α基因適合做分子標(biāo)記，可準(zhǔn)確地對賈第蟲進行基因分型。同時，本試驗所測得的賈第蟲EF1α序列系國內(nèi)首次報道，為賈第蟲的分子遺傳學(xué)及分子流行病學(xué)的進一步研究提供了有價值的科學(xué)資料。

［1］Xiao L，F(xiàn)ayer R.Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission［J］.Int J Parasitol，2008，38（11）：1239－1255.

［2］Sulaiman I M，F(xiàn)ayer R，Bern C，et a1.Triosephosphate isomerase gene characterization and potential zoonotic transmission ofGiardiaduodenalis［J］.Emerg Infect Dis，2003，9（11）：1444－1452.

［3］CacciòS M，Ryan U.Molecular epidemiology of giardiasis［J］.Mol Biochem Parasitol，2008，160（2）：75－80.

［4］Sandhu H，Mahajan R C，Ganguly N K.Flowcytometric assessment of the effect of drugs on Giardia lamblia trophozoitesinvitro［J］.Mol Cell Biochem，2004，265：151－160.

［5］Elmendorf H G，Dawson S C，McCaffery J M.The cytoskeleton of Giardia lamblia［J］.Int J Parasitol，2003，33（1）：3－28.

［6］盧思奇.國內(nèi)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲研究［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，1999，6（4）：193－197.

［7］衛(wèi) 茹，田喜風(fēng)，閻靜波，等.藍(lán)氏賈第鞭毛蟲感染的免疫學(xué)診斷方法［J］.世界華人消化雜志，2006，14：3487－3492.

［8］Smith H V，Cacci S M，Cook N，et a1.Cryptosporidium and Giardia as foodborne zoonoses［J］.Vet Parasitol，2007，149（1－2）：29－40.

［9］Scaramozzino P，Cave D D，Berrilli F，et al.A study of the prevalence and genotypes of Giardia duodenalis infecting kennelled dogs［J］.Vet J，2009，182（2）：231－234.

［10］CacciòS M，Thompson R C，Mclauchlin J，et al.Unravelling Cryptosporidium and Giardia epidemiology［J］.Trends Parasitol，2005，21（9）：430－437.

［11］肖淑敏，李國清，王 波，等.我國首株牛源賈第蟲的分子鑒定［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2006，22（9）：861－863.

［12］朱海波，李國清，張 萍，等.廣東首株犬源賈第蟲的基因型鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（2）：143－147.

［13］Minvielle M C，Molina N B，Polverino D，et al.First genotyping of Giardia lamblia from human and animal feces in Ar－gentina，South America［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2008，103（1）：98－103.

［14］CacciòSM，De Giacomo M，Pozio E.et al.Sequence analysis of beta－giardin gene and development of a polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human faecal samples［J］.Int J Parasitol，2002，32（8）：1023－1030.

［15］Lalle M，Pozio E，Capelli G，et al.Genetic heterogeneity at theβ－giardin locus among human and animal isolates of Giardia duodenalis and identification of potentially zoonotic subgenotypes［J］.Int J Parasitol，2005（2）：35：207－213.