齊景偉，徐萌杰，劉淑英＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

內(nèi)源性逆轉錄病毒在數(shù)百萬年前整合到脊椎動物的基因組中，在胚胎形成過程扮演重要角色，起到增強遺傳基因功能，并保護宿主免受相關外源致病性病毒侵害的作用［1］。綿羊基因組中含有與外源性綿羊肺腺瘤逆轉錄病毒（Exogenous Jaagsiekte heep retrovirus，exJSRV）密切相關的約20拷貝內(nèi)源性逆轉錄綿羊肺腺瘤病毒（Endogenous Jaagsieke sheep retrovirus，enJSRV）序列，其中exJSRV 是傳染性綿羊肺腺瘤?。∣vine pulmonary adenomatois，OPA）的致病因子，而透明質(zhì)酸酶2（hyaluroniase 2，HYAL2）是enJSRV 和exJSRV 的共同受體［2］。近年來，學者們對enJSRV、exJSRV 和綿羊三者之間相互作用的研究很感興趣，進一步探究逆轉錄病毒與其宿主在進化過程中所發(fā)揮的復雜的作用提供了一個獨特的模式系統(tǒng)，具有里程碑的意義［3］。但是，對生殖系統(tǒng)相關組織中enJSRV的研究尚處于探索階段，對反芻動物妊娠早期調(diào)節(jié)絨毛膜滋養(yǎng)層細胞增殖和分化的分子機制也仍然是個未解之謎［4］。因此，檢測綿羊胚胎發(fā)育過程中enJS RV及其受體HYAL2的表達就成為揭示其生物學作用的關鍵。目前，尚無關于妊娠蒙古綿羊絨毛膜中enJSRV及其受體HYAL2表達特性的報道。本研究采用組織原位雜交技術和Taq Man實時熒光定量PCR對其在不同妊娠時期蒙古綿羊絨毛膜的分布定位和表達規(guī)律進行了研究，以探索二者在蒙古綿羊胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用，為進一步揭示enJSRV的生殖生物學作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢材 屠宰不同妊娠時期（30、50、70、90、110、130d，交配日＝0d）的蒙古綿羊，每組3只，分別迅速剝離取絨毛膜組織樣品各兩份，一份放入40mL／L多聚甲醛／0.1mol／L PBS固定液中固定10h，梯度脫水后用石蠟包埋，另一份存于液氮中。1.1.2 主要試 劑 RNAiso Plus、DL 500DNA Marker、DL 2 000DNA Marker、PrimeScript One Step RT－PCR Kit Ver.2、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time、Premix Ex Taq（Perfect Real Time）、Digoxigenin RNA labeling kit、Anti－digoxigenin－AP Fab fragment等購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR探針和引物的設計與合成 根據(jù)Gen－Bank中已登錄的綿羊enJSRV、HYAL2和β－actin序列，利用DNA Star軟件設計并合成如下探針和引物（表1）。

表1 enJSRV，受體HYAL2和管家基因β－actin的引物序列Table 1Primer sequences for enJSRV，receptor HYAL2andβ－actin house keeping genes

1.2.2 總RNA的提取和反轉錄 將不同妊娠時期蒙古綿羊的絨毛膜組織采用液氮搗碎法［4］處理，然后根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司的Trizol試劑說明書抽提總RNA，并用微量紫外分光光度計（型號：ND－1000NanoDrop，美國）和10g／L變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及完整性。反轉錄體系為10μL：5×Prime Script buffer（for Real Time）2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ0.5μL，Oligo dT Primer（50μmol／L）0.5μL，Random 6mers（100μmol／L）2μL，Total RNA，最后加RNase Free dH2O 至10μL。37℃15min，85℃5s。所得產(chǎn)物即為妊娠蒙古綿羊各時期絨毛膜組織的cDNA。以cDNA為模板進行內(nèi)參基因β－actin的PCR擴增，判斷是否逆轉錄成功。

1.2.3 熒光定量PCR的穩(wěn)定性和重復性的檢測微量紫外分光光度計測30d妊娠蒙古綿羊絨毛膜組織的濃度后，取4ng／μL依次進行10倍梯度稀釋，作為相應的標準品。將標準品進行10倍梯度稀釋，分別用熒光定量PCR檢測，根據(jù)獲得的Ct值檢測該方法的靈敏性。對10倍～3倍比稀釋液的標準品分別做5個反應管，檢測比較同一次反應不同反應管間的批內(nèi)變異。熒光定量PCR反應體系為25μL，其中cDNA 2μL，Premix Ex Taq （2×）12.5μL，上游引物（10pmol／μL）0.5μL，下游引物（10pmol／μL）0.5μL，熒光探針溶液1μL，RNase Free dH2O 8.5μL于實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。聯(lián)機運行軟件為 MJ Opticon Moni－tor TM Analysis Software Version 3.1，采用兩步法運行程序：95℃預變性3 0s；95℃5s，60℃30s，40個PCR循環(huán)。

1.2.4 標準曲線的建立 將10倍梯度稀釋的各個標準品的起始拷貝數(shù)取常用對數(shù)，作為橫坐標，其所對應的Ct值作為縱坐標，即可做出相應的標準曲線。反應體系及運行條件同1.2.3。

1.2.5 妊娠蒙古綿羊各時期絨毛膜組織enJSRV及其受體HYAL2基因表達水平的檢測 將妊娠蒙古綿羊各時期絨毛膜組織的cDNA作為模板，進行熒光定量PCR，獲得相應的Ct值。根據(jù)熒光曲線的Ct值以及標準曲線計算定量結果SPSS。反應體系及運行條件同1.2.3。

1.2.6 SP正、反義RNA探針的合成 PCR產(chǎn)物經(jīng)20g／L變性瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測擴增片段大小。經(jīng)純化后，用TA克隆的方法將該目的片段克隆到pMD 19－T Vector載體中。將構建好的質(zhì)粒轉化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆進行培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I進行酶切，使其完全線性化，回收純化酶切片段，以其為模板，用地高辛標記試劑盒內(nèi)（Roche，Cat.№11 175 025 910，德國）的 SP6 和T7轉錄酶進行體外轉錄，合成地高辛標記的enJSRV及其受體 HYAL2正、反義探針。用變性瓊脂糖電泳和微量紫外分光光度計（型號：ND－1000 NanoDrop，美國）對合成的探針進行初步鑒定。最后經(jīng)斑點雜交（dot blot）方法分析探針的標記效率及濃度。

1.2.7 原位雜交檢測enJSRV及其受體 HYAL2 mRNA在絨毛膜的定位 將烘烤后的切片（5μm）經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精下行至無RNase水，空氣干燥后用蛋白酶 K／0.1mol／L PBS（pH 7.4）消化1min～2min，經(jīng)甘氨酸處理進行雜交前預處理。在每張切片上滴加20μL預雜交液（5×SSC，5×Denhardt，50%去離子甲酰胺，10／L SDS，200μg／mL鮭魚精DNA）濕盒內(nèi)在42℃恒溫箱預雜交1h后，再滴加20μL雜交液（5×SSC，5×Denhardt，50%去離子甲酰胺，10g／L SDS，250μg／mL鮭魚精DNA，100g／L硫酸葡聚糖，探針于濕盒內(nèi)在42℃恒溫箱雜交18h。雜交后經(jīng)SSC、封閉液、抗地高辛AP液、馬來酸緩沖液、顯色緩沖液、NBT／BCIP顯色液、無酶水、伊紅復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后封片照相。除使用相應的正義探針代替反義探針外其余試驗步驟完全相同做正義探針對照試驗。

2 結果

2.1 熒光定量PCR的穩(wěn)定性和重復性

所有樣品的總RNA經(jīng)微量紫外分光光度計（型號：ND－1000NanoDrop，美國）檢測，測得其吸光度A260／A280比值均在1.8～2.0之間，可用于 mRNA的表達分析。之后將標準品按體積比1∶10倍比稀釋后作為定量PCR的模板進行檢測。對10倍～3倍比稀釋液的標準品做5個反應管檢測，同一次反應不同反應管的批內(nèi)變異系數(shù)為0.92%，說明該方法的穩(wěn)定性和重復性都很好，適于利用該方法進行后續(xù)試驗。

2.2 妊娠蒙古綿羊各時期絨毛膜enJSRV及其受體HYAL2基因相對表達水平的檢測

以β－actin基因為內(nèi)參，由內(nèi)參的定量結果求出RNA量的誤差（本試驗是對于30d絨毛膜組織的相對值），用enJSRV及其受體 HYAL2基因的定量結果除以上述誤差值，以校正enJSRV及其受體HYAL2基因的定量結果，由校正值計算出樣品間對于30d絨毛膜的相對值（圖1）。圖1表明妊娠蒙古綿羊在各時期絨毛膜組織中均有enJSRV及其受體HYAL2的表達。通過統(tǒng)計學分析得出，妊娠蒙古綿羊絨毛膜組織中enJSRV mRNA的表達于妊娠50d時表達量最低，70d和110d相對較高，且差異都極顯著（P＜0.01），到130d時又降低到起始水平；受體HYAL2的表達于130d時表達量最低，90d相對較高，且差異都極顯著（P＜0.01）。而enJSRV與其受體HYAL2mRNA之間無線性相關性（圖1）。

圖1 enJSRV及其受體HYAL2基因在各時期的相對表達水平Fig.1Expression level of enJSRV and HYAL2 gene in different periods

2.3 探針檢測結果

探針的檢測結果如圖2，從上到下依次為control DNA、地高辛標記的enJSRV和HYAL2探針形成的斑點。根據(jù)試劑盒說明書的稀釋濃度圖中數(shù)字1～5表示按control DNA的濃度分別為10、3、1、0.3、0.1pg／μL的倍比稀釋。通過比對計算得出enJSRV正、反義探針濃度分別為3.75pg／μL和4.65pg／μL；HYAL2探針濃度分別為3.25pg／μL和3.40pg／μL。

圖2 探針靈敏度檢測Fig.2Detection of sensibility of probes

2.4 enJSRV及其受體 HYAL2在妊娠蒙古綿羊絨毛膜的表達定位

采用地高辛標記的enJSRV及其受體HYAL2 cRNAs探針對不同妊娠時期蒙古綿羊絨毛膜進行原位雜交。結果顯示，enJSRV及其受體 HYAL2 mRNAs在妊娠30、50、130d蒙古綿羊絨毛膜組織中均有陽性信號出現(xiàn)。從圖3中藍紫色陽性信號分布情況可見，enJSRV 及其受體 HYAL2mRNAs特異性表達在絨毛膜的滋養(yǎng)層巨型雙核細胞（trophoblastic giant binucleated cell，BNC）、多核合胞體小半鞘翅（multinucleate syncytial plaque，SP）和滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，Tr）。在相應的正義探針對照試驗中均無陽性信號出現(xiàn)。

圖3 原位雜交檢測enJSRV及其受體HYAL2在妊娠蒙古綿羊絨毛膜的表達Fig.3Expression of enJSRV and HYAL2mRNAs in the chorion of pregnant Mongolian ewes

3 討論

絨毛膜由滋養(yǎng)層及襯于其內(nèi)面的胚外中胚層組成，其外表面有大量絨毛，絨毛上皮表面覆蓋大量微絨毛，絨毛的發(fā)育及微絨毛的出現(xiàn)使絨毛膜與子宮蛻膜的接觸面積大大增加，有利于胚胎與母體之間進行物質(zhì)交換［5］。隨著胚胎發(fā)育，叢密絨毛膜與基蛻膜共同構成了胎盤。當囊胚著床后，滋養(yǎng)層細胞分裂增殖，進而分化融合為合胞體滋養(yǎng)層細胞，形成絨毛干，構成完備的母體胚胎胎盤循環(huán)，以滿足妊娠子宮的血供需求，所以胎盤的正常形成是維系胚胎生長發(fā)育的關鍵所在，而期間必有重要的生物分子以特異的表達形式和規(guī)律參與［6－8］。近年來的研究表明，內(nèi)源性逆轉錄病毒（ERV）在胎盤中的表達可能參與妊娠過程中的局部免疫調(diào)節(jié)，介導細胞間的相互作用，并防止外源性逆轉錄病毒的胎期傳染［9－11］。

本試驗中發(fā)現(xiàn)，enJSRV在蒙古綿羊不同妊娠期的絨毛膜組織中均有表達，且特異性表達在絨毛膜的滋養(yǎng)層巨型雙核細胞、多核合胞體小半鞘翅和滋養(yǎng)外胚層。其中enJSRV mRNA在絨毛膜的表達于妊娠50d時最低，這可能是由于在妊娠的早期，或者是妊娠中期的早期，絨毛膜正在發(fā)育分化，還未形成胎盤，沒有母體血液供應時，靠子宮內(nèi)膜腺上皮產(chǎn)生的碳水化合物和富含脂質(zhì)的分泌物來提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時調(diào)節(jié)母胎界面的免疫反應和絨毛滋養(yǎng)細胞的浸潤，進而維持胚胎的存活和正常胎盤的發(fā)育。到妊娠110d，enJSRV mRNA在絨毛膜的表達量較高，這一時期絨毛膜與子宮蛻膜牢固連接，胎盤已完全形成，胚胎進入發(fā)育成熟階段，需要汲取大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此作為維持母體與胚胎之間物質(zhì)交換的絨毛干發(fā)揮著關鍵作用。而妊娠130d時，enJSRV mRNA表達水平降低，此期綿羊處于臨產(chǎn)期，胎盤已發(fā)育成熟，其屏障作用減弱，因而出現(xiàn)排斥現(xiàn)象而將胚胎排出體外；再者，胚胎大約在完全發(fā)育成熟時，當所產(chǎn)生的在免疫學上有保護作用的細胞數(shù)量降到最低時，才會使母畜發(fā)生免疫學反應，排斥胚胎［12］。Dunlap K A 等［13］研究者通過體內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)在胎盤發(fā)育期，enJSRV的表達被阻止后，胎盤的生長速度下降，絨毛滋養(yǎng)層大型雙核細胞（giant binucleate cell，BNC）停止發(fā)育，結果胚胎不能正常著床，導致綿羊流產(chǎn)。說明enJSRV參與調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)層的生長，影響胎盤發(fā)育，誘導機體產(chǎn)生免疫耐受，是妊娠所不可或缺的因素。

另外，絨毛膜的合體滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生絨毛膜促性腺激素（chorionic gonadotropin，CG），CG的主要功能就是刺激黃體的生成，利于雌激素和孕酮持續(xù)分泌，以促進子宮蛻膜的形成，使胎盤生長成熟［14］。研究表明，CG在妊娠期的分泌水平與enJSRV的表達相一致。因此，將enJSRV的mRNA表達量的變化規(guī)律與妊娠綿羊絨毛膜發(fā)育過程和功能結合考慮，推測enJSRV參與妊娠過程中絨毛滋養(yǎng)層細胞的分化融合，促進胎盤的發(fā)育完善，同時有助于宿主的防御。

透明質(zhì)酸酶2（HYAL2）是enJSRV與exJSRV的共同受體，當enJSRV與受體HYAL2結合后，會降低exJSRV可利用的受體，防止相應外源性病毒的侵入［15］。而當enJSRV 和exJSRV 同表達在一個宿主細胞內(nèi)時，enJSRV形成的病毒粒子不能釋放出宿主細胞表面，它還阻止exJSRV形成的病毒粒子的釋放，進而保護宿主免受感染［16］。本試驗中發(fā)現(xiàn)在絨毛膜enJSRV的受體HYAL2表達量90d相對較高，這可能由于該階段正是胎盤形成期，絨毛膜增生明顯，大量細胞增殖分化，致使機體內(nèi)透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA ）的濃度升高，相應降解HA的 HYAL2也高表達。而妊娠早期（30d）和妊娠晚期（130d）絨毛膜內(nèi)的 HYAL2mRNA表達量則均較低，此時絨毛膜或處于未分化期或處于早已發(fā)育成熟期，機體還未有大量細胞的增殖和分化，或機體不再需要細胞大量的增殖和分化，其調(diào)節(jié)因子透明質(zhì)酸的濃度明顯下降，HYAL2的表達隨之較低。

本試驗表明，enJSRV與其受體 HYAL2mRNA之間表達量無線性相關。盡管enJSRV與其受體HYAL2以絨毛膜滋養(yǎng)細胞為位點相互作用，調(diào)控胎盤形成發(fā)育，但可能由于二者的表達調(diào)控機制不同，致使它們間無線性相關性。

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