蘇桂源 鄧海軍 孫凱 余江 李國新

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510515

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化道常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)明確結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因參與的過程，而抑癌基因的失活在癌的發(fā)生中具有重要作用，研究新的抑癌基因?qū)Y(jié)直腸癌的診斷治療及預(yù)后有重要意義。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)對(duì)生物體生長發(fā)育和分化調(diào)控起著重要作用，其表達(dá)失衡可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［1-2］。miRNA-338-3p(miR-338-3p)是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為參與腫瘤的演進(jìn)過程，但其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀況及其調(diào)控靶目標(biāo)鮮見研究報(bào)道［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察結(jié)直腸癌與毗鄰癌旁組織中miR-338-3p差異表達(dá)狀況，并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系及對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值，探討miR-338-3p在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

40例結(jié)直腸癌及對(duì)照癌旁組織標(biāo)本取自南方醫(yī)院2008年9—11月間手術(shù)患者，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)。其中男性21例，女性19例；年齡(55.8±11.2)歲；結(jié)腸癌24例，直腸癌16例。完善相關(guān)病理資料，包括腫瘤細(xì)胞分化程度、浸潤層次、TNM分期(NCCN 2009版)、CEA水平等。癌旁組織取自距離癌腫5 cm的腸黏膜，另切取距離癌腫10 cm以上腸黏膜作為正常對(duì)照?；颊咝g(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本采集后快速放至液氮中冷凍，-80 ℃保存。

1.2 隨訪資料

隨訪時(shí)間自術(shù)后第1天至末次隨訪或死亡時(shí)間，以月為計(jì)算單位，隨訪至2011年11月截止，隨訪時(shí)間最長36個(gè)月，最短4個(gè)月，死亡11例，隨訪方式為門診復(fù)查、信件及電話隨訪。

1.3 試劑與儀器

TRIzol試劑購自Invitrogen公司，Allin-One? miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購自GeneCopoeia公司，DU800核酸蛋白分析儀購自美國Beckman Coulter公司，PCR儀采用ABI Prism?7500。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

由miRBase數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/)和GenBank查找基因序列，使用Primer-Express 2.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，miR-338-3p及內(nèi)參照RNU6B由GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)合成。

1.5 Real-time RT-PCR檢測(cè)標(biāo)本中miR-338-3p表達(dá)

常規(guī)TRIzol試劑抽提總RNA，DEPC水溶解沉淀，應(yīng)用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度，根據(jù)RNA在A260nm/A280nm≥1.8及甲醛變性凝膠電泳28 S、18 S的RNA條帶亮度比值≥1.5鑒定RNA純度及完整性。miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：往冰上預(yù)冷的RNase free反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25 μL：終濃度為2.0 μg的總RNA 2.0 μL、2.5 U/μL PolyA聚合酶 1.0 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶RTase Mix 1.0 μL、5×Reaction Buffer 5.0 μL、去RNase無菌蒸餾水16 μL；混勻配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37 ℃反應(yīng)60 min，結(jié)束后再進(jìn)行85 ℃ 5 min滅活處理，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋5倍進(jìn)行下游qPCR實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建miR-338-3p和RNU6B的Real-time Q-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL、2×All-in-ONE Q-PCR Mix 10 μL、通用PCR引物2.0 μL、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、無菌蒸餾水3.6 μL、miR-338-3p或RNU6B引物2.0 μL；qPCR反應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)的三步法進(jìn)行：95 ℃預(yù)熱10 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析66 ℃～95 ℃、升溫速率為每次0.5 ℃、恒溫時(shí)間每次6 s，每個(gè)標(biāo)本均作復(fù)管PCR反應(yīng)，并重復(fù)3次。

1.6 PCR產(chǎn)物的定量校正和判定標(biāo)準(zhǔn)

以RNU6B作為內(nèi)參照，用RNU6B的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過Light Cycler軟件直接獲得各樣本中miR-338-3p的Ct(cycle threshold)值，與同樣本中RNU6B的Ct值相減，即獲得該樣本中miR-338-3p的ΔCt值；由于以Real-time Q-PCR來檢測(cè)RNA時(shí)，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄效率的限制，我們?cè)僖哉Ｄc黏膜的ΔCt值作為校正，得出-ΔΔCT值，ΔΔCT=(CTmiR-338-3p-CTU6)目的樣本-(CTmiR-338-3p-CTU6)校正樣本，按目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCT公式計(jì)算各樣本中miR-338-p的確切含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)兩兩比較t檢驗(yàn)；腫瘤臨床病理參數(shù)與miR-338-3p表達(dá)水平之間的關(guān)系分析采用Mann-Whitney檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier法分析生存期并繪制生存曲線，生存曲線的比較用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR反應(yīng)效果及特異性

40例樣本中miR-338-3p cDNA顯示呈指數(shù)增長，并擴(kuò)增達(dá)到平臺(tái)期，Ct值處于15～35之間，其擴(kuò)增曲線為一組典型的S型曲線(圖1)，擴(kuò)增效率理想。通過設(shè)置復(fù)孔取平均值，即得到各樣本中目的基因擴(kuò)增的Ct值作為miR-338-3p定量判定。PCR完成后于溶解程序中收集熒光信號(hào)，得到熔解曲線，miR-338-3p對(duì)應(yīng)的Tm值為(77.43±0.14) ℃，熔解溫度均一，峰形單一銳利，證明反應(yīng)特異性良好，無非特異擴(kuò)增、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)(圖2)。

2.2 miR-338-3p含量測(cè)定

與癌旁組織相比，miR-338-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)(0.122 6±0.087 3vs0.905 8±0.410 5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 miR-338-3p表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

miR-338-3p表達(dá)水平與腫瘤TNM分期(P=0.031)、浸潤深度(P=0.001)以及分化程度(P=0.042)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、CEA水平無關(guān)(表1)。

表 1 miR-338-3p表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between miR-338-3p expression and clinicopathological features in colorectal cancer patients

2.4 miR-338-3p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

以結(jié)直腸癌患者的術(shù)后3年無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)及總生存期(overall survival，OS)分別繪制生存曲線，取樣本中miR-338-3p表達(dá)水平的平均值0.122 6閾值，將40例樣本分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)果miR-338-3p低表達(dá)組與高表達(dá)組的PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)，低表達(dá)組的手術(shù)預(yù)后效果顯著低于高表達(dá)組(圖3)；而miR-338-3p低表達(dá)組與高表達(dá)組的OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.214，圖4)。

3 討 論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟的發(fā)展過程，同樣也是多基因發(fā)生異常變化的過程，隨著研究的發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)標(biāo)志表達(dá)變化被確認(rèn)與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，并具有相應(yīng)的臨床價(jià)值［4］。miRNA是存在于生物體內(nèi)的一類長度約為19～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，既往研究證實(shí)miRNA對(duì)生命體的生長發(fā)育、增殖分化等基本生物學(xué)行為起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，而其失衡表達(dá)亦可促進(jìn)多種人類疾病尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，miRNA與腫瘤調(diào)控關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)［5-6］。

miR-338-3p是新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。國內(nèi)學(xué)者曾應(yīng)用液相芯片篩選肝細(xì)胞癌與毗鄰癌旁組織中差異表達(dá)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-338-3p在肝細(xì)胞癌中表達(dá)顯著下調(diào)；進(jìn)一步應(yīng)用Hierarchical Cluster軟件以miR-338-3p為標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)標(biāo)本進(jìn)行聚類分析時(shí)，可將肝細(xì)胞癌與毗鄰癌旁組織明顯分開［7］。本研究結(jié)果亦證實(shí)，miR-338-3p在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平較癌旁組織顯著下降，提示miR-338-3p下調(diào)可能作為“抑癌基因”的表達(dá)缺失而參與了腫瘤始發(fā)及演進(jìn)，但其具體發(fā)揮何種抑癌生物學(xué)作用尚不清楚。miR-338-3p定位于染色體17q25.3，而染色體17q23-25位點(diǎn)常是多種惡性腫瘤的突變“熱點(diǎn)”，且其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，此現(xiàn)象亦提示了miR-338-3p可能參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的惡性進(jìn)程，亦與我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的miR-338-3p在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中表達(dá)水平更行下降的狀況相一致，說明miR-338-3p可能是一種與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的“抑癌基因”。

結(jié)直腸癌的臨床病理特征是判斷腫瘤惡性程度及預(yù)后的主要依據(jù)［8］，本研究結(jié)果表明，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p表達(dá)水平顯著低于Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌組織；癌組織的局部浸潤達(dá)到T4期的miR-338-3p表達(dá)水平顯著低于T1～T3期；分化程度低的結(jié)直腸癌組織miR-338-3p表達(dá)水平顯著低于高、中分化的結(jié)直腸癌組織。因此miR-338-3p的低表達(dá)不僅與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，并且與腫瘤的侵襲、浸潤及分化程度相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者術(shù)后30%～50%會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)者80%～90%發(fā)生在術(shù)后2～3年內(nèi)［9-11］。本研究的3年隨訪資料顯示，在PFS的比較中miR-338-3p低表達(dá)組的生存時(shí)間顯著低于高表達(dá)組，雖然OS兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低表達(dá)組的生存率(65.2%)低于高表達(dá)組(82.4%)，提示miR-338-3p表達(dá)水平越低，其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性越大，臨床預(yù)后越差。

綜上所述，miR-338-3p與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能也是結(jié)直腸癌的一個(gè)抑制侵襲轉(zhuǎn)移因子，其低表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期、浸潤深度以及分化程度密切相關(guān)，并可作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的新的生物標(biāo)志物。

［1］BANDRES E, AGIRRE X, BITARTE N, et al.Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer ［J］.Int J Cancer, 2009, 125(11): 2737-2743.

［2］SUN K, WANG W, ZENG J J, et al.MicroRNA-221 inhibits CDKN1C/p57 expression in human colorectal carcinoma［J］.Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(3): 375-384.

［3］TSUCHIYA S, OKU M, IMANAKAI Y, et al.MicroRNA-338-3p and microRNA-451 contribute to the formation of basolateral polarity in epithelial cells ［J］.Nucleic Acids Res, 2009, 37(11): 3821-3827.

［4］HE L, HE X, LIM L P, et al.A microRNA component of the p53 tumor suppressor network ［J］.Nature, 2007,447(7148): 1130-1134.

［5］GUARNIERI D J, DILEONE R J.MicroRNAs: a new class of gene regulators ［J］.Ann Med, 2008, 40(3): 197-208.

［6］NG E K O, CHONG W W S, JIN H, et al.Differential expression of MicroRNA in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening［J］.Gut, 2009, 58(10): 1375-1381.

［7］HUANG X H, WANG Q, CHEN J S, et al.Bead-based microarray analysis of microRNA expression in hepatocellular carcinoma: miR-338 is down-regulated ［J］.Hepatol Res,2009, 39(8): 786-794.

［8］SCHETTER A J, LEUNG S Y, SOHN J J, et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma ［J］.JAMA, 2008, 299(4):425-436.

［9］TSUKUMA H, AJIKI W, IOKA A, et al.Survival of cancer patients diagnosed between 1993 and 1996: a collaborative study of population-based cancer registries in Japan ［J］.Jpn J Clin Oncol, 2006, 36(9): 602-607.

［10］PARK Y J, PARK K J, PARK J G, et al.Prognosis factor in 2230 Korean colorectal cancer patients: analysis of consecutively operated cases ［J］.World J Surg, 1999,23(7): 721-726.

［11］陳永勝, 丁璐璐, 張永輝, 等.江蘇省啟東市2001-2007年結(jié)直腸癌患者生存率分析 ［J］.中國癌癥雜志, 2011,21(2): 134-139.